Identificação de regiões codificantes de proteína através da transformada modificada de Morlet
Jesús P. Mena-Chalco

Dissertação apresentada ao Instituto de Matemática e Estatística da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências. Área de Concentração: Ciência da Computação. Orientador: Prof. Dr. Roberto Marcondes Cesar Junior

Durante o desenvolvimento deste trabalho o autor recebeu auxílio financeiro da CAPES

São Paulo, 19 de outubro de 2005

Banca Examinadora:
Prof. Dr. Roberto Marcondes Cesar Junior - IME-USP.
Prof. Dr. Roberto Hirata Júnior - IME-USP.
Profa. Dra. Helaine Carrer - ESALQ-USP.

Resumo

Um tópico importante na análise de seqüências biológicas é a busca de genes, ou seja, a identificação de regiões codificantes de proteínas. Esta identificação permite a posterior procura de significado, descrição ou categorização biológica do organismo analisado. Atualmente, vários métodos combinam reconhecimento de padrões com conhecimento coletado de conjuntos de treinamento ou de comparações com banco de dados genômicos. Entretanto, a acurácia desses métodos está ainda longe do satisfatório. Novos métodos de processamento de seqüências de DNA e de identificação de genes podem ser criados através da busca por conteúdo (search-by-content). O padrão periódico de DNA em regiões codificantes de proteína, denominada periodicidade de três bases, vem sendo considerado uma propriedade dessas regiões. As técnicas de processamento digital de sinais fornecem uma base robusta para a identificação de regiões com periodicidade de três bases.

Nesta dissertação, são apresentados um pipeline bioinformático, os conceitos básicos da identificação genômica, e métodos de processamento digital de sinais utilizados para a identificação de regiões codificantes de proteínas. Introduzimos um novo método para a identificação dessas regiões, baseado na transformada proposta, denominada Transformada Modificada de Morlet. Apresentamos vários resultados experimentais obtidos a partir de seqüências de DNA sintéticas e reais. As principais contribuições do trabalho consistem no desenvolvimento de um pipeline bioinformático para projetos genoma e na criação de um método de identificação de regiões codificantes onde a periodicidade de três bases seja latente. O método apresenta desempenho superior e vantagens importantes em comparação ao método tradicional baseado na transformada de Fourier de tempo reduzido.

Palavras-chave: identificação de genes, periodicidade nos éxons, transformada modificada de Morlet, processamento digital de sinais, pipeline, bioinformática.

Abstract

An important topic in biological sequences analysis is gene finding, i.e. the identification of protein coding regions. This identification allows the posterior research for meaning, description or biological categorization of the analyzed organism. Currently, several methods combine pattern recognition with knowledge collected from training datasets or from comparison with genomic databases. Nonetheless, the accuracy of these methods is still far from satisfactory. New methods of DNA sequences processing and genes identification can be created through search-by-content such sequences. The periodic pattern of DNA in protein coding regions, called three-base periodicity, has been considered proper of coding regions. Digital signal processing techniques supply a strong basis for regions identification with three-base periodicity.

In this work, we present a bioinformatics pipeline, basic concepts of the genomic identification and digital signal processing methods used for protein coding regions identification. We introduce a new method for identification of these regions, based on a newly proposed transform, called Modified Morlet Transform. We present some obtained experimental results from synthetic and real DNA sequences. The main contributions consist of the bioinformatics pipeline development for genoma projects and the creation of a method for protein coding regions identification where the three-base periodicity is latent. The method presents superior performance and important advantages in comparison to traditional method based on the short time Fourier transform.

Keywords: genes identification, periodicity in exons, modified Morlet transform, digital signal processing, pipeline, bioinformatics.


Sumário

Agradecimentos

Com muita saudade, e temor de esquecer de alguém, posso escrever que este trabalho é o resultado dos quase vinte e seis meses na minha vida de pós-graduação no IME-USP. Meses sempre cheios do que realmente gosto: ``da vida'', vida que não é a minha.

Gostaria de expressar minha gratidão profunda à minha família: Emílio, Júlia, Rafael, Senovia e Madelyn, que deram-me muito amor, imenso sustento e incentivo. Não importaria o lugar, sempre sentiria saudades de vocês. À minha família em São Paulo: Christian, Cristian, Gustavo e Karina, pelo constante apoio e por tudo o que compartimos.

Agradeço profundamente ao meu orientador, e amigo, professor Roberto Marcondes Cesar Junior por dar-me a oportunidade de pesquisar nesta área e fundamentalmente por acreditar em mim; por explicar-me, com todos seus comentários, a concentrar-me as vezes no como e as vezes no porque. É ele quem tem-me conduzido na pesquisa, sempre me suportou e me orientou tanto como eu podia aprender sobre minha ignorância, sendo sempre um exemplo para mim.

Sou grato aos professores Helaine Carrer e Roberto Hirata Júnior por todas as recomendações e correções dadas na versão prévia deste trabalho e no exame de qualificação. As idéias sugeridas foram de muita utilidade na continuação do trabalho. Também reitero meus agradecimentos por terem aceitado participar como a presente banca de defesa de minha dissertação de mestrado.

Sou grato ao Yossi Zana e ao David da Silva Pires pelas correções, grande ajuda critica nos meus trabalhos, pela sempre boa disposição para tudo, muitas ensinanças e grande amizade. Agradeço, também, ao professor Paulo José da Silva e Silva pelo grande apoio inicial, exemplo e amizade. Gostaria de agradecer à professora Helaine Carrer, Henrique, Adriano, Valesca e todo o pessoal do laboratório de Biotecnologia Agrícola do Departamento de Ciências Biológica da ESALQ-USP, por dar-me a oportunidade de conhecer mais sobre biologia molecular e bioinformática. Aos professores Wilber Ramos, Juan Carlos Juarez, Iván Montes e Ernesto Cuadros pelo apoio quando eu o precisava antes de começar o mestrado.

Agradeço ao André Yoshiaki Kashiwabara, Henrique Alves, Said Sadique Adi e Vladimir Moreira pela amizade, sugestões, correções, e frutíferas conversas que animaram-me muito no estudo deste trabalho. Aos meus amigos Ana Beatriz, Anderson, Ariane, Celina, Claudia, Clodis, Cristian Noriega, Daniel Dantas, Daniel Vaquero, Daniel Vieira, David Junior, Eduardo Guerra, Eduardo Ueda, Elier, Fábio, Gustavo, Jishu, João, Jorge, Kelly, Lourdes, Ricardo, Silvia, Thiago Santos, Thiago Sousa e Walter obrigado pela amizade, compreensão e muitas ensinanças. Não esqueço de todos os meus demais amigos que têm feito cheia de experiências a vida toda. Agradeço especialmente à Elizabeth pela muita paciência, carinho e todo o mundo implícito.

No final mas não por último, esta dissertação nunca teria sido concebida sem o apoio financeiro da CAPES, professores, estudantes, admins e funcionários do IME-USP. Que mais linhas para escrever e dar um ``muito obrigado!''?.

Lista de Abreviaturas

bp Par de base (Base pair).
BAC Cromossomo artificial bacteriano (Bacterial artificial chromosome).
CDS Região codificante de proteína (Coding sequence, protein coding sequence).
DNA Ácido desoxirribonucléico (Desoxyribonucleic acid).
DSP Processamento Digital de Sinais (Digital signal processing).
EIIP Potencial de interação elétron-íon (electron-ion interaction potentials).
EST Seqüência expressa (Expressed sequence tag).
mRNA RNA mensageiro (Messenger RNA).
MMT Transformada modificada de Morlet (Modified Morlet transform).
RNA Ácido ribonucléico (Ribonucleic acid).
STFT Tranformada de Fourier de tempo reduzido (Short-time Fourier transform).
TBP Periodicidade de três bases (Three-base periodicity).
YAC Cromossomo artificial de levedura (Yeast artificial chromosome).

Lista de Símbolos

$^\ast$ Complexo conjugado.
$a$ Escala.
$j$ Número imaginário, $\sqrt{-1}$.
$s$ Sinal (discreto ou contínuo).
$t$ Tempo ou posição.
$\omega$ Freqüência angular.
$\psi$ Função de análise wavelet.
$\Psi$ Transformada de Fourier de $\psi$.
$\vert.\vert$ Valor absoluto de um número.
A Base adenina.
C Base citocina.
G Base guanina.
T Base Timina.
U Base Uracila.
N Qualquer base ( A, C, G, ou T).
$\mathcal{C}$ Conjunto de números complexos.
$\mathcal{R}$ Conjunto de números reais.
$S$ Transformada de Fourier de $s$.
$E$ Esperança.
$u_X$ Seqüência binária associada às posições da base X.
$U_X$ Transformada de Fourier da seqüência $u_X$.
$arg$ Argumento de um número complexo.
$std$ Desvio padrão.


Lista de Figuras


Lista de Tabelas


1. Introdução


1.1 Considerações Preliminares

A bioinformática ou biologia computacional, vem ganhando importância pelas suas descobertas na busca de um maior entendimento dos organismos [7,39]. Importantes avanços nessa área devem-se ao desenvolvimento dos métodos e técnicas de seqüenciamento automático de grandes volumes de fragmentos de DNA, predição de estruturas secundárias do RNA e construção de árvores filogenéticas.

Quando um novo organismo é seqüenciado, tipicamente deseja-se obter toda a informação útil do organismo. Um passo fundamental nesse processo é a identificação de todos os genes presentes na estrutura do DNA. Um passo posterior e igualmente importante para atingir sua anotação genômica é procurar seqüências similares às identificadas. Pode-se, assim, conhecer diferentes aspectos sobre uma seqüência molecular mediante as classificações e comparações de organismos similares já bem estudados.

Com os projetos genoma1.1 em fase de seqüenciamento e em grande escala, métodos computacionais tornam-se necessários para identificar genes sobre as seqüências de DNA e saber, com eficiência e confiabilidade, a estrutura dos genes; e, como, quando e quanto é expresso [24].

O problema da identificação de genes corresponde, na verdade, à tarefa de determinar as regiões codificantes de proteínas (CDSs, coding sequences) das duas fitas de um fragmento de DNA, que representem as possíveis estruturas biológicas, parciais ou completas, dos genes [61]. Com tal identificação é possível determinar as funções de cada uma das proteínas produzidas pelos genes, e pode-se compreender mais sobre o organismos biológico. Em termos computacionais, podemos ver esse problema como sendo a tarefa de determinar a seqüência de caracteres componentes (sobre o alfabeto A, C, G, T) de cada um das CDSs em um fragmento de DNA, onde A, C, G e T representam os nucleotídeos correspondentes à seqüência de DNA.

Muitos problemas práticos foram encontrados na utilização de abordagens propostas anteriormente, ou combinações delas, para a identificação de genes [9], visto que ainda não se conhecem completamente, ou não existem formulações robustas que poderiam ser utilizadas para modelar a expressão e estrutura dos genes sobre seqüências de DNA. Entretanto, dispõe-se de métodos, como os descritos em [26,61], que auxiliam os pesquisadores e dão, com certo nível, resultados próximos aos reais. Além dos métodos desenvolvidos nos últimos 20 anos [26], foram criadas metodologias computacionais que combinam busca de padrões com conhecimento obtido das comparações dos bancos de dados de seqüências ou conjunto de treinamento de genes conhecidos.

Novos métodos de processamento digital de sinais (DSP, digital signal processing) aplicados em bioinformática ou biologia computacional [13,34,62] estão sendo usados nessas áreas por serem rápidos, e consistirem em uma outra abordagem alternativa com um arcabouço matemático robusto. Os métodos de DSP foram usados para identificar éxons em algumas células eucariotas [4,51,57] apresentando resultados promissores.

Todos esses métodos tratam a abordagem de busca por conteúdo por meio da procura de periodicidade de três nucleotídeos (TBP, three-base periodicity) presentes somente nas CDSs. Esta abordagem não se limita a conjuntos de genes bem caracterizados necessários na etapa de treinamento de métodos que utilizam outras abordagens. A TBP é considerada um indicador da localização das CDSs em organismos eucariotos e procariotos. Em combinação com outras abordagens esperamos obter um método mais robusto e com alto nível de acurácia.


1.2 Objetivos

O objetivo principal deste trabalho consiste no estudo e desenvolvimento de um método novo que utilize uma transformada de sinais, chamada aqui de Transformada Modificada de Morlet (MMT, Modified Morlet transform) para a detecção das CDSs com TBP em seqüências de DNA. Esta transformada permitirá analisar uma seqüência de DNA somente na freqüência correspondente à TBP.

Além desse objetivo, temos o desenvolvimento de um pipeline bioinformático em colaboração com o Laboratório de Biotecnologia Agrícola para o apoio no processamento e montagem do genoma completo de cloroplasto de Eucaliptus grandis e análise de ESTs (expressed sequence tags)1.2 da bactéria Pantoea agglomerans. Para o cumprimento desse objetivo, contamos com a orientação da Profa. Dra. Helaine Carrer do Departamento de Ciências Biológicas da ESALQ-USP.


1.3 Contribuições

As principais contribuições deste trabalho estão discriminadas abaixo:


1.4 Organização do Trabalho

No Capítulo 2, apresentamos os conceitos biológicos fundamentais da biologia molecular necessários para a compreensão do problema da identificação de CDSs. Discutimos também uma representação das regiões constituintes dos genes, bem como o Dogma Central da biologia molecular. Descrevemos o processo adotado para seqüenciar um genoma completo, e explicamos as evidências de existência de periodicidade nas CDSs. No final do capítulo, realizamos uma breve descrição das categorias de estratégias para a identificação de genes.

No Capítulo 3, apresentamos a definição de um pipeline bioinformático e mostramos uma configuração intuitiva das ferramentas computacionais existentes para o processo de identificação de bases, montagem, edição das leituras e anotação para projetos genoma. No final desse capítulo descrevemos ainda o pipeline bioinformático desenvolvido para o recebimento e administração de placas de seqüenciamento, análises de qualidade, filtragem, mascaramento, montagem de seqüências, e comparações dos fragmentos obtidos com seqüências de DNA de organismos conhecidos.

No Capítulo 4 são revisadas as definições básicas da análise de Fourier e mapeamento de nucleotídeos para o tratamento das seqüências simbólicas de DNA como seqüências numéricas. Para avaliar os métodos de identificação de CDSs, realizamos uma análise de espectros de freqüência e de periodicidade para seqüências sintéticas e reais de DNA amplamente utilizadas na literatura. Discutimos vários métodos de DSP baseados em uma análise tempo-freqüência referentes à identificação de CDSs. Apresentamos alguns resultados preliminares do uso de tais métodos. Finalmente, tratamos as medidas de acurácia utilizadas na avaliação dos métodos de identificação de genes.

No Capítulo 5 são revisadas as definições básicas da análise em wavelets e é apresentada a definição da transformada modificada de Morlet usada neste trabalho. Descrevemos o novo método desenvolvido para a identificação de CDSs em seqüências de DNA onde a TBP seja latente. Este método divide o processo no mapeamento de seqüências de DNA, aplicação da MMT, projeção dos coeficientes da MMT, e limiarização dos coeficientes de projeção para a detecção das possíveis fronteiras entre as CDSs.

No Capítulo 6 apresentam-se resultados experimentais do método proposto para a identificação de CDSs. Discutimos experimentos comparativos entre os métodos através da MMT e da STFT em seqüências sintéticas e reais. Para avaliar o desempenho dos métodos na identificação de CDSs utilizamos medidas de acurácia. Um aspecto explorado nas comparações dos experimentos é a questão da limiarização como uma forma lógica de obtenção das fronteiras entre as CDSs.

No Capítulo 7 discutimos algumas conclusões obtidas neste trabalho. Analisamos as vantagens e desvantagens do método proposto para a identificação de CDSs. Apresentamos um esquema que ilustra o posicionamento de nossa contribuição em relação as principais referências da área. Finalmente, sugerimos algumas pesquisas futuras como continuação do trabalho.

Em anexos constam uma descrição das seqüências de DNA testados no trabalho (Apêndice A), estimativas de periodicidades em seqüências sintéticas com ruído (Apêndice B), tabelas de acurácia obtidas para a avaliação dos métodos utilizados para a identificação de CDSs (Apêndice C), assim como as publicações realizadas deste trabalho (Apêndice D).


2. Conceitos Biológicos

Consideramos, ao longo deste trabalho, de maneira indistinta, o uso dos termos nucleotídeos e bases de DNA. Consideramos também que o comprimento de uma seqüência de DNA ou RNA é medido pela quantidade de nucleotídeos existentes somente em uma fita. A unidade utilizada é par de base (bp, base pair).


2.1 Fundamentos Biológicos


2.1.1 Ácidos Nucléicos

Todo organismo vivo, sem nenhuma exceção conhecida, armazena sua informação biológica na forma de moléculas de ácidos nucléicos, formadas por nucleotídeos, para se construir e manter. Cada nucleotídeo, por sua vez, consiste de: (1) uma molécula de açúcar (desoxirribose ou ribose), (2) um grupo fosfato e, (3) uma segunda molécula chamada base nitrogenada [2].

Existem cinco tipos de bases nitrogenadas. As encontradas no ácido desoxirribonucléico (ADN ou DNA, Desoxyribonucleic acid) são adenina ( A), citosina ( C), guanina ( G) e timina ( T), de modo que uma seqüência de bases nitrogenadas do DNA será formada apenas por A, C, G e T. No ácido ribonucléico (RNA) há uma substituição da timina pela uracila ( U) e a seqüência do RNA é formada pelas bases A, C, G e U.

O ácido desoxirribonucléico, é representado como uma fita dupla complementar e antiparalela2.1, sendo por meio dos nucleotídeos que as duas fitas componentes de molécula de DNA permanecem ligadas. O DNA possui o esquema de emparelhamento onde o nucleotídeo A sempre liga-se ao nucleotídeo T e o nucleotídeo C sempre liga-se ao nucleotídeo G por pontes de hidrogênio. Por convenção, uma molécula de DNA começa no lado $5'$ e termina no lado $3'$, onde $5'$ e $3'$ correspondem aos átomos de carbono livres da molécula de açúcar presentes em cada nucleotídeo [2]. Cada uma das fitas componentes da molécula possui uma orientação própria, onde o final de uma corresponde ao início da outra (Fig. 2.1).

Figura 2.1: Representação do DNA como uma fita dupla complementar e antiparalela.
\includegraphics[scale=.5]{dna_dupla_fita}

O ácido ribonucléico (ARN ou RNA, Ribonucleic acid), é representado como uma fita única de ácidos nucléicos, que diferente do DNA, têm o açúcar ribose e a uracila em vez da timina. Essa fita é obtida através da transcrição de uma das fitas do DNA (Fig. 2.2(c)). São três os tipos de RNA: (1) o RNA mensageiro (mRNA), que contém a informação para a codificação das proteínas, (2) o RNA transportador (tRNA), que é o responsável pelo transporte de aminoácidos, e (3) o RNA ribossomal (rRNA), que possui um papel estrutural.

As diferenças entre o DNA e o RNA não se restringem aos tipos de nucleotídeos constituintes. Na maioria das vezes, o DNA é apresentado como uma longa hélice dupla e com uma estrutura secundária regular e simples. Já o RNA apresenta-se como uma fita única e de tamanho menor que o DNA, com uma grande diversidade de estruturas secundárias relacionadas às funções do DNA e do RNA na célula [2].


2.1.2 Aminoácidos

Os aminoácidos são moléculas orgânicas que contém átomos de carbono, hidrogênio, oxigênio e nitrogênio em sua composição, sendo o resultado da tradução de agrupamentos funcionais de moléculas de DNA. Os aminoácidos formam pequenas cadeias de polímeros chamados polipeptídeos, peptídeos ou monômeros de proteínas.

Dos mais de 500 tipos de aminoácidos encontrados na natureza, são 20 os mais comuns ou universalmente aceitos para a síntese, isto é, codificação de proteínas. Os vegetais têm a capacidade de produzir esses 20 aminoácidos necessários para a produção de suas proteínas. Entretanto, as células de animais não produzem todos eles, sendo que alguns devem ser ingeridos. Assim, os aminoácidos são classificados em essenciais, que não podem ser produzidos pelos animais e, os não-essenciais que podem ser produzidos por animais.

Adotaremos a representação clássica [2] de uma e três letras para cada um dos 20 aminoácidos (Tab. 2.1).


Tabela 2.1: Códigos, abreviaturas e nomes dos aminoácidos.
Código Abreviatura Nome completo
A Ala Alanina
C Cys Cisteína
D Asp Ácido aspártico
E Glu Ácido glutamico
F Phe Fenilalanina
G Gly Glicina
H His Histidina
I Ile Isoleucina
K Lys Lisina
L Leu Leucina
M Met Metionina
N Asn Asparagina
P Pro Prolina
Q Gln Glutamina
R Arg Arginina
S Ser Serina
T Thr Treonina
V Val Valina
W Trp Tiptofano
Y Tyr Tirosina



2.1.3 Genes

Os genes são os responsáveis pela expressão de uma proteína, ou pelo controle da expressão de outros genes [2]. Todos os genes têm uma estrutura complexa, mas para fins práticos consideramos os genes como constituídos pelas seguintes regiões características:

  1. Região de reconhecimento (região promotora);
  2. Início de transcrição;
  3. Região não-traduzida $5'$, que regula a transcrição gênica;
  4. Início de tradução, ou códon de início (start codon);
  5. Região para a codificação de proteínas (CDS). Para procariotos considera-se uma única região. Entretanto, nos genes dos organismos eucariotos é considerada uma seqüência alternada de éxon/íntron separadas por regiões de corte doadora (donor splice site ou $5'$ splice site) e corte aceitadora (acceptor splice site ou $3'$ splice site). Consideramos um éxon como uma região necessária para a codificação de proteínas, e um íntron como uma região não presente na codificação com funções ainda desconhecidas;
  6. Parada de tradução, ou códon de parada (stop codon);
  7. Região não-traduzida $3'$;
  8. Região de poliadenilação rica em Adenina (polyA) unicamente presente nos eucariotos;
  9. Parada de transcrição.

As funções das regiões de DNA existentes entre os genes (regiões inter-gênicas) ainda não são conhecidas por completo [2]. O processo de duplicação2.2 do DNA é chamado de replicação de DNA (Fig. 2.2(a)). A transcrição de uma seqüência de DNA em uma outra é chamada de pré-mRNA (Fig. 2.2(b)) e o processo que permite a retirada dos íntrons para a obtenção do mRNA é chamada de corte (splicing) (Fig. 2.2(c)). Certos genes podem fazer esta retirada de forma variante, chamada de corte alternativo (alternative splicing). O processo biológico que faz a codificação do mRNA, mediante o tRNA e ribossomo, é chamado de tradução (Fig. 2.2(d)).

Figura 2.2: Representação do Dogma Central da Biologia Molecular: (a) fita de DNA contendo regiões gênicas, (b) fita de pré-mRNA onde estão representados os éxons e íntrons, (c) fita de mRNA, com íntrons removidos, (d) uma seqüência de aminoácidos que, traduzidos, formam uma proteína.
\includegraphics[scale=.5]{dogma_central}

Existe um caso não usual de genes que são transcritos mas não traduzidos, chamados de genes de RNA não-codificantes (noncoding RNA genes). Veja [61] para uma descrição detalhada da estrutura de um gene e classificação dos tipos de éxons.

Neste trabalho, consideramos as CDSs como sendo uma única região dentro dos genes procariotos. Nos eucariotos, como várias regiões chamadas de éxons e separados por íntrons. Portanto, todos os íntrons e as regiões inter-gênicas são consideradas como não-codificantes.


2.1.4 Códigos Genéticos e Proteínas

O código genético, ou código de aminoácidos, é um conjunto de regras que usam as células vivas para decodificar seu genoma necessário para a síntese de proteínas. Esta codificação é feita de cada CDS. Usualmente, o código genético é escrito como um conjunto de 64 códons2.3 dos quais três são indicadores de parada da síntese de proteínas.

O código genético é talvez o maior descobrimento depois do DNA, pois ajudou a compreender melhor a estrutura genética dos organismos. Todos os organismos vivos usam o mesmo ou pequenas variações do código genético padrão [30] (Tab. 2.2) onde os códons de início estão representados pela letra M e os códons de parada pelo símbolo *. Em [30,42], S. Osawa e T. H. Jukes atribuíram para cada taxonomia dos organismos variações do código genético padrão com base nas evidências de seqüências homólogas e/ou relações filogenéticas. Uma das variações do padrão utilizadas na comparação de seqüências de proteínas é a de bactérias e plastídeos de plantas, onde foram encontrados sete códons de início (Tab. 2.2).


Tabela 2.2: Código genético padrão e de bactérias/plastídeos de plantas. Os códons de iniciação estão representados pela letra M e os códons de parada pelo símbolo *.
Aminoácidos FFLLSSSSYY**CC*WLLLLPPPPHHQQRRRRIIIMTTTTNNKKSSRRVVVVAAAADDEEGGGG
1$^\circ$ nucleotídeo TTTTTTTTTTTTTTTTCCCCCCCCCCCCCCCCAAAAAAAAAAAAAAAAGGGGGGGGGGGGGGGG
2$^\circ$ nucleotídeo TTTTCCCCAAAAGGGGTTTTCCCCAAAAGGGGTTTTCCCCAAAAGGGGTTTTCCCCAAAAGGGG
3$^\circ$ nucleotídeo TCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAG
Códon de iniciação padrão ...M...............M...............M............................
Códon de iniciação bactérias ...M...............M............MMMM...............M............


O Dogma Central da biologia molecular (Fig. 2.2) é considerado como o processo de replicação, transcrição do DNA e tradução das CDSs. Esses processos são importantes pois deles dependem todas as atividades celulares [2]. Vale salientar que quando um gene é expresso, fornece as instruções à célula para produzir uma proteína específica. As células em um organismo possuem o mesmo DNA, isto é, o mesmo conjunto de genes, mas diferentes genes são expressos funcionalmente nas diferentes células, permitindo assim a diferenciação celular.


2.2 Seqüenciamento Genômico

Para a montagem genômica (Seção 3.1.2), geralmente adota-se o método de seqüenciamento fragmentado em milhares de pequenos pedaços (e.g. 3.156 milhões de fragmentos para o genoma da Drosophila de aproximadamente 120Mbp [21]), para depois serem lidos por um equipamento de seqüenciamento automático.

Neste trabalho, tratamos o seqüenciamento genômico como um processo para determinar a ordem ou a estrutura dos nucleotídeos em uma amostra. Em projetos genoma é utilizado o método de fragmentação do genoma de um organismo em pequenos pedaços para, em seguida, seqüenciá-los. Com ajuda de ferramentas computacionais, podemos montá-los e, assim, reconstruir a informação genômica do organismo tratado. Atualmente é impossível seqüenciar diretamente blocos contínuos de milhares de nucleotídeos. Geralmente, são usados fragmentos cujas quantidades de nucleotídeos superam em 14 vezes a quantidade do genoma total.

Existem vários métodos de seqüenciamento genômico disponíveis que apresentam vantagens e desvantagens [2]. Em projetos genoma de procariotos, cópias múltiplas do DNA inteiro são cortadas em fragmentos pequenos por enzimas de restrição ou por processos físicos. Esse método é chamado shotgun, e depois do primeiro passo os fragmentos são clonados em vetores plasmidiais que são seqüenciados em suas extremidades. Após a primeira etapa de montagem desse genoma, fragmentos maiores são clonados em cosmídeos e seqüenciados. Essa etapa é importante para a montagem do genoma completo do organismo porque a primeira normalmente produz uma seqüência incompleta apresentando alguns ``buracos'' de seqüência. Os fragmentos sobrepostos criados são a parte fundamental para a montagem.

Em projetos genoma de eucariotos, que tratam uma enorme quantidade de DNA, comumente é usado o método shotgun hierárquico onde o DNA inteiro do organismo é primeiramente inserido em grandes vetores de clonagem, como cromossomos artificiais de bactérias (BAC, bacterial artificial chromosome) ou leveduras (YAC, yeast artificial chromosome). Depois, é realizado o shotgun desses grandes fragmentos dos vetores, gerando fragmentos menores que são clonados em vetores plasmidiais para o seqüenciamento.

Estes projetos, geralmente, consistem de duas etapas: (1) a montagem de cada um dos fragmentos clonados nos BACs e YACs, e (2) a montagem final que reunirá as seqüências completas dos BACs e YACs montados para a reconstituição da informação genômica inicial. Um fragmento pode ser único ou uma das muitas seqüências repetidas. Diferentes partes do genoma são bastante similares na seqüência, e certamente essas regiões são as mais difíceis de montar. O genoma deve ser seqüenciado nessa grande escala para garantir estatisticamente a existência de redundância entre os fragmentos e reduzir as chances que se perca regiões do genoma. Os resultados do seqüenciamento são conhecidos como fragmentos ou leituras (reads).


2.3 Periodicidade nas CDSs

As CDSs, isto é, as regiões no DNA que codificam em proteínas, tipicamente exibem uma organização periódica de três bases que não é encontrada em outras regiões como (1) as regiões inter-gênicas, e (2) os íntrons nos eucariotos. Nos últimos anos essa característica nas CDSs tem sido analisada para explicar sua causa [25,43,53,56,64] e quantificá-la [20,47]. Na literatura, esta periodicidade é chamada de periodicidade de três bases (TBP, three-base periodicity), tendo sido observada de maneira semelhante para di-nucleotídeos em cromossomos de bactérias [35].

Esta periodicidade mostra relações entre as posições dos nucleotídeos nos éxons que, acredita-se, seja causada pela assimetria na composição das bases nas três posições codificantes [25]. Em [20] concluiu-se que as freqüências não uniformes do codon usage são a principal causa para a determinação dessa periodicidade e que a natureza do código genético é responsável pelo comprimento do período, mas não pela própria periodicidade.

Trifonov [54,55], explica que a TBP é dada pela preferência por $G$ na primeira posição, e na falta de $G$ na segunda posição dos códons [($G$-não$G$-$N$)$n$] tanto para seqüências de organismos procariotos quanto eucariotos, sugerindo que esse padrão no mRNA possa ser responsável pela monitoração da leitura correta da tripla de nucleotídeos (frame) durante a tradução. Vale salientar que foram encontradas algumas exceções desta propriedade genômica nas CDSs em alguns procariotos e seqüências virais e mitocôndriais [32]. Para as regiões inter-gênicas da bactéria E. coli foi encontrada periodicidade próxima a 11 bases [29], e sugeriu-se que seja uma propriedade típica das regiões inter-gênicas de organismos procariotos acreditando-se que regula a transcrição.

Entretanto, essa TBP nas CDS não é uniforme, ou seja, é latente, contendo repetições imperfeitas. Entenda-se como periodicidade latente de uma seqüência de DNA a periodicidade com baixo nível de homologia entre quaisquer dois períodos na seqüência de DNA [31].

Finalmente, acreditamos que estamos em uma etapa inicial da explicação da causa e quantificação da periodicidade. O estudo da periodicidade no DNA é importante para o entendimento de uma seqüência de DNA e para o desenvolvimento de métodos de identificação gênica.


2.4 Identificação de Genes

Atualmente, a identificação de genes é a maior área de pesquisa em análise de seqüências de DNA [33]. No processo tratado sobre o Dogma Central da biologia molecular (Seção 2.1.3) várias características podem ser notadas e usadas na dedução computacional da estrutura dos genes, ou seja, a identificação de genes. Esta inclui promotores e regiões reguladoras, limites entre éxons e íntrons, e sinais de início e parada de tradução [7,37,39].

No nível de DNA, são três as categorias que agrupam as abordagens tipicamente adotadas para a identificação de regiões funcionais que codificam elementos responsáveis para a estrutura dos genes, regulação e transcrição. A seguir, descrevemos brevemente cada uma delas:

  1. Métodos baseados em reconhecimento de padrões:
    1. Busca por sítios2.4 (search-by-sites), baseados em modelos probabilísticos, onde procura-se a presença ou ausência de uma seqüência específica, padrão ou consenso associado à expressão gênica (como a procura de promotores, ou sítios de transcrição ou tradução, ou regiões de poliadenilação).

      Nesta categoria, está incluída a procura por uma seqüência consenso ou uma expressão que descreva uma seqüência consenso, com algumas variações. O uso de matrizes de pesos no lugar do consenso são geralmente utilizadas [26].

      A grande dificuldade para estes métodos é que os sítios nem sempre estão presentes nas seqüências de DNA, e quando o estão, nem sempre estão no mesmo contexto de onde foram concebidos [7].

    2. Busca por conteúdo (search-by-content), onde procura-se segmentos com propriedades existentes somente nas regiões da seqüência de DNA (como a procura de freqüência de nucleotídeos, composição de nucleotídeos ricos em G/C ou em A/T, composição de códons e ilhas de CpG2.5).

      Para discriminar CDS de não-CDS, geralmente são usados modelos estatísticos da freqüência de nucleotídeos e dependências presentes na estrutura do códon [26], analisando a complexidade composicional da seqüência.

      Uma vantagem desta abordagem é que nenhuma seqüência similar é necessária para identificar os genes codificantes de proteínas, pois a identificação é obtida da própria seqüência [33].

  2. Métodos baseados em comparações por homologia com proteínas, onde são inferidas funções e localização dos genes por homologia se a seqüência é similar a uma outra seqüência anotada existente. Estes métodos são restritivos pois, para genes recentemente descobertos, muitas vêzes não tem-se nenhum casamento com outras proteínas conhecidas [7,39].

  3. Métodos baseados no uso de expressed sequence tags (ESTs), onde são procuradas subseqüências de cDNA, que é derivado do mRNA, dentro das seqüências de DNA [7].

Todos os métodos conhecidos, atualmente, são sensíveis e dependentes da natureza dos dados analisados, sendo a intuição ou domínio do conhecimento dos especialistas um fator fundamental no processo da identificação de genes e posterior anotação genômica.

O problema de identificação de genes está longe de ser resolvido e a principal dificuldade é encontrada no que define realmente um gene. Biólogos moleculares encontraram alguns genes de comprimento mais curtos do que os esperados inicialmente [27]. Um desempenho melhor de uma identificação requererá melhor conhecimento biológico sobre porque os genes têm as características até agora encontradas [33].

Neste trabalho, nos concentramos na busca por conteúdo para identificação de CDSs, sendo usada a TBP (Seção 2.3) como um bom indicador de suas localizações. Pode ser encontrada em [26,61] uma descrição ampla das ferramentas utilizadas para a identificação computacional de genes de eucariotos.


3. Pipeline Bioinformático

Depois do seqüenciamento genômico, é particularmente necessária a determinação da longa seqüência original de DNA para sua posterior anotação. Assim, procedimentos biológicos e/ou computacionais, tal como um pipeline bioinformático, são fundamentais para auxiliar todo o processo de uma maneira simples, lógica e ordenada.

Pipeline bioinformático (bioinformatics pipeline) é um termo usado, mas vagamente definido em bioinformática. Aqui o definimos como uma seqüência de unidades ou etapas funcionais que realizam uma tarefa genômica em diferentes passos biológicos e/ou computacionais, em que cada unidade funcional recebe entradas e produz saídas que são armazenadas em arquivos ou bancos de dados especiais para sua posterior interpretação biológica. Uma saída de uma unidade funcional é uma entrada da unidade seguinte, sendo que operações dentro de uma unidade podem ser realizadas em paralelo.

3.1 Unidades Funcionais

A organização das unidades funcionais em um pipeline bioinformático para projetos genoma depende do tipo, características e necessidades do projeto em que deseja-se utilizar (para recentes exemplos, ver [21,41,46]). Entretanto, nas seguintes subseções, apresentamos uma organização típica e simplificada dessas unidades funcionais (Fig. 3.1).

Figura 3.1: Organização típica de um pipeline bioinformático para projetos genoma. Cada bloco representa uma unidade funcional e cada seta o fluxo da informação.
\includegraphics[scale=0.5]{pipeline_esquema}


3.1.1 Identificação de Bases

As entradas para o pipeline bioinformático são as leituras (reads) dos fragmentos produzidos pelo seqüenciador automático de DNA com informações analógicas que representam os nucleotídeos lidos deste equipamento (raw data), chamados de arquivos de cromatograma, de um dos fragmentos próprios do método de seqüenciamento.

Para converter esses dados analógicos em fragmentos de bases, as leituras são submetidas a um programa de identificação, denominado base-caller, o qual as identifica como A, C, G ou T, atribuindo um valor de qualidade para cada um. O rótulo N é atribuído no caso de um nucleotídeo não ser identificado ou possuir uma qualidade muito baixa (Fig. 3.2).

A orientação de um fragmento é desconhecida e freqüentemente as máquinas de seqüenciamento automático apresentam erros nas leituras dos fragmentos de DNA. Uma boa parte dos fragmentos contém erros em uma taxa de 1 a 5%. Muito mais erros ocorrem nos extremos das leituras [39,45].

Figura 3.2: Representação da identificação de bases de leituras de três fragmentos arbitrários. As bases com valor de baixa qualidade são denotadas com letras minúsculas.
\includegraphics[scale=.8]{identificacao_nucleotideos}

Nos trabalhos de Ewing [22,23], as atribuições dos valores confiáveis aos nucleotídeos são dadas por um algoritmo que tem como base a análise de Fourier [38]. O valor de qualidade de uma base em um fragmento é $ q = -10 \log_{10} p $, onde $p$ é a probabilidade de erro estimado para a base. Assim, os valores de qualidade estão definidos para inteiros positivos pequenos para cobrir um amplo intervalo de probabilidade de erro. Esse valor é importante para determinar se um fragmento precisa ser re-seqüenciado.


3.1.2 Montagem do Genoma

Esta etapa consiste na geração da seqüência genômica a partir dos fragmentos já digitalizados. Os programas utilizados são baseados em algoritmos heurísticos e de programação dinâmica de alinhamento de seqüências que essencialmente procuram encontrar redundâncias entre fragmentos, agrupando os que tenham uma parte comum, que formam fragmentos maiores, chamados fragmentos consensos ou contíguos (contigs ou contiguous.) [39].

Os genomas de diferentes organismos da mesma espécie não são idênticos devido ao polimorfismo entre eles (e.g. estima-se uma diferença em uma taxa de 1 em 1000 bases para o genoma de duas pessoas diferentes [2]). Assim, as regiões no genoma com alta taxa de polimorfismo são um problema nesta etapa da montagem [45].

O seqüenciamento termina quando o aumento no número de fragmentos não contribui para o alongamento dos consensos, resultando ainda em regiões onde não se conhece a seqüência devido a contaminantes nas flutuações de clonagem, presença de seqüências repetidas, dentre outros [39]. Pode-se usar métodos biológicos alternativos para adicionar mais fragmentos, podendo também ser retirados do conjunto de entrada. A montagem termina quando produz tantos consensos quanto replicons3.1 do genoma e todas as bases tenham um valor de qualidade aceitável dependendo do valor estabelecido para o projeto.

Existem diferentes maneiras para certificar que uma seqüência genômica seja a correta [2]. A seqüência pode ser comparada com pequenas partes de um genoma que tenha sido seqüenciado e anotado previamente ou com regiões de mapas genômicos. Se uma montagem é consistente com regiões dispersas de informação conhecida, então é bastante provável que toda a seqüência seja a correta [48].


3.1.3 Edição das Leituras

Esta etapa consiste nas operações de substituição, remoção ou inserção de bases. Permitindo assim a correção de possíveis erros cometidos na identificação de nucleotídeos e nos erros da própria montagem. Em geral, isso pode ser feito devido à existência de um ou mais fragmentos que tenham bases adequadas com qualidade alta para inferir a correção da base incorreta [41].


3.1.4 Anotação do Genoma

Esta etapa é crítica porque consiste na identificação de regiões onde estão localizados os possíveis genes para depois determinar quais são suas funções, descrições ou categorizações biológicas [45,48]. As operações comuns nesta etapa são:

  1. Identificação dos genes (Seção 2.4);

  2. Descrição de genes, geralmente realizada com ajuda de outras montagens de outros organismos, cujas funções já são conhecidas, pois as seqüências de organismos estruturalmente similares podem ter também funções similares. Esta tarefa pode ser realizada de forma semi-automática para a ajuda na classificação dos genes identificados;

  3. Construção do mapa genético, mostrando a disposição, orientação e categoria geral dos genes do organismo montado.

Veja [48], para uma descrição detalhada das categorias típicas de anotação, técnicas usadas, e modelos sociológicos que têm sido adotados pelos pesquisadores.

3.2 Pipeline Bioinformático Desenvolvido

Nesta seção, apresentamos uma descrição do pipeline bioinformático que desenvolvemos no Laboratório de Bioinformática do Departamento de Ciência da Computação do IME-USP, em colaboração com o Laboratório de Biotecnologia do Departamento de Ciências Biológicas da ESALQ-USP, sob a orientação da Profa. Dra. Helaine Carrer.

O pipeline bioinformático desenvolvido é tratado como um conjunto de ferramentas computacionais configuradas para (1) o recebimento e administração de placas de seqüenciamento, (2) análises de qualidade por placa, (3) filtragem e mascaramento de seqüências, (4) montagem dos fragmentos de DNA e, (5) comparações dos fragmentos obtidos com seqüências de DNA de organismos conhecidos.

Atualmente, este pipeline bioinformático (Fig. 3.3), disponível para uso em http://malariadb.ime.usp.br:8026/pipeline, sob o sistema operacional SUNOS $^{\textrm{\scriptsize\texttrademark}}$ 5.8, apóia a montagem do genoma completo de cloroplasto de Eucaliptus grandis e na análise de ESTs da bactéria Pantoea agglomerans.

Figura 3.3: Interface web inicial do pipeline bioinformático desenvolvido.
\includegraphics[scale=0.65]{pipeline_interface04}


3.2.1 Arquitetura e Implementação

Na Figura 3.4 ilustramos um esquema correspondente à arquitetura do pipeline bioinformático desenvolvido. A seguir descrevemos a interface web, o sistema de gerenciamento e as cinco unidades funcionais deste pipeline.

Figura 3.4: Esquema da arquitetura do pipeline bioinformático desenvolvido.
\includegraphics[scale=0.4]{pipeline_desenvolvido}

Um processo típico para um projeto arbitrário poderia ser o seguinte. Quando uma placa de seqüenciamento é submetida ao pipeline bioinformático, será realizada a identificação de bases, filtragem, mascaramento, e análise de qualidade de seqüências. Este primeiro passo permite descartar seqüências com qualidade baixa. Um processo seguinte permite a montagem genômica somente com as seqüências obtidas no processo anterior para a placa submetida, como também para o processo de montagem das seqüências de todas as placas. Toda a informação sobre a montagem é coletada (coleção de informação), isto é, são armazenados o número de seqüências válidas, de singlets, e de contigs.

Para o processo de montagem de todas as placas, são realizadas as comparações dos singlets e contigs obtidos com (1) seqüências conhecidas e registradas no NCBI, e (2) um genoma completo conhecido, previamente indicadas no sistema de gerenciamento. Os resultados finais da montagem e das comparações são agrupados para a geração de relatórios da análise genômica (fusão de informação). Todos os resultados são apresentados através da interface web.


3.2.2 Relatórios de Análise

O pipeline bioinformático apresenta vários relatórios correspondentes a cada projeto registrado, sendo os mais importantes:

No tempo da escrita deste trabalho conta-se com 87 placas submetidas e processadas, fazendo um total de 7399 leituras, 11 singlets, e 212 contigs na montagem do genoma de cloroplasto de Eucaliptus grandis. Conta-se com 26 placas, fazendo um total de 1899 leituras, 693 singlets, e 194 contigs na análise de ESTs da bactéria Pantoea agglomerans.


4. Métodos de DSP para a Identificação de CDSs

As regiões codificantes de proteínas (CDSs) em seqüências de DNA apresentam tipicamente uma organização periódica de três bases não uniforme (TBP) e que ainda não é compreendida completamente (Seção 2.3). Nota-se que vários métodos foram criados para a identificação de CDSs (Seção 2.4) baseados na busca dessa característica.

Neste capítulo, revisamos as definições básicas da análise de Fourier, mapeamento numérico de nucleotídeos, espectros de freqüência de DNA, análise de periodicidade de DNA, e apresentamos os principais métodos de processamento digital de sinais (DSP) que compõem o estado da arte no que se refere à identificação de CDSs através da busca da TBP.


4.1 Análise de Fourier

Uma aspecto importante da análise de Fourier deve-se ao fato dela possibilitar uma representação de uma classe ampla de funções em termos de uma combinação linear de funções base senos, cossenos ou exponenciais complexos [15]. Uma outra forma de pensar na análise de Fourier é como uma técnica matemática para transformar nossa visão de informação baseada no tempo (posição ou espaço) naquela baseada na freqüência [44].


4.1.1 Transformada de Fourier

A transformada de Fourier é utilizada para decompor um sinal em componentes que representem freqüências, descrevendo o sinal de forma uni-dimensional e global. Existem variações, desta transformada, diretamente relacionadas a ela, que dependem do tipo de função a transformar [38]. Esta transformada invertível representa de forma não ambígua o sinal e define a noção de freqüência global no sinal.

A transformada contínua de Fourier (CFT, Continuous Fourier transform) é referida para funções contínuas, que representem qualquer função integrável $f(t)$ como a integral de exponenciais complexas com freqüência angular $\omega$ e amplitude complexa $F(\omega) \in \mathcal{C}$ [10],

\begin{displaymath} F(\omega) = \int_{-\infty}^{\infty} f(t) e^{-j\omega t} dt \end{displaymath} (4.1)

Assim, a transformada inversa de Fourier para funções contínuas, $f(t) \in \mathcal{C}$, é definida por
\begin{displaymath} f(t) = \frac{1}{2\pi} \int_{-\infty}^{\infty} F(\omega) e^{j\omega t} d\omega \end{displaymath} (4.2)

Analogamente, a transformada discreta de Fourier (DFT, Discrete Fourier transform) da função $f[b]$ pode ser definida como

\begin{displaymath} F[k] = \sum_{b=0}^{n-1} f[b] e^{-2 \pi j k b/n }, \quad k=0,\dots,n-1 \end{displaymath} (4.3)

sendo definida a transformada inversa de Fourier para funções discretas como
\begin{displaymath} f[b] = \frac{1}{n} \sum_{k=0}^{n-1} F[k] e^{-2 \pi j k b/n }, \quad b=0,\dots,n-1 \end{displaymath} (4.4)

A transformada de Fourier tem um inconveniente pois transformar ao domínio da freqüência resulta em uma perda da informação relativa ao tempo. Portanto, é impossível indicar quando um evento particular ocorre [44].


4.1.2 Espectro de Freqüência

O espectro de freqüência é uma representação de um sinal em termos de freqüência (Seção 4.1.1, sendo esse considerado uma projeção do sinal sobre um conjunto de funções base senoidais. Os espectros de freqüência contêm informação de amplitude e de fase [38].


4.1.3 Convolução

A convolução é um operador matemático entre duas funções $f$ e $g$, que produz uma terceira função, que de certa forma, represente a quantidade de sobreposição entre $f$ e uma versão invertida e deslocada de $g$ em diferentes instantes de tempo. A convolução de $f$ e $g$, denotada $f*g$, é definida como a integral do produto de duas funções após uma ser invertida e deslocada [15,38].

Para o caso de funções contínuas, a convolução $h(\tau)$ será dada por

\begin{displaymath} h(\tau) = f(\tau)*g(\tau) = (f * g)(\tau) = \int_{-\infty}^{\infty} f(t)g(\tau-t) dt \end{displaymath} (4.5)

em que a faixa de integração depende do domínio no qual as funções estejam definidas. Por outro lado, para funções discretas, a convolução é dada por
\begin{displaymath} h[b] = f[b]*g[b] = (f * g)[b] = \sum_{k} f[k]g[b-k] \end{displaymath} (4.6)


4.1.4 Transformada de Fourier de Tempo Reduzido

Uma alternativa para a análise bi-dimensional e local de dados é dada pela transformada de Fourier de tempo reduzido (STFT, do inglês Short-time Fourier transform), que introduz uma janela de extensão limitada que permite selecionar uma parte do sinal. A STFT é usada para determinar como a amplitude senoidal e fase de um sinal muda no tempo, dando alguma informação sobre quando e em que freqüências um evento em um sinal ocorre, com uma precisão limitada e determinada pelo tamanho da janela. Esta transformada mapeia o sinal em um plano tempo4.1-freqüência [38,44].

Para um sinal contínuo $f(t)$ define-se a STFT como

\begin{displaymath} \mbox{STFT}(b, \omega) = \int_{-\infty}^{\infty} g^\ast(t-b) f(t) e^{-j \omega t} dt \end{displaymath} (4.7)

em que $g(t)$ representa a função janela centrada em $b$ [38]. Analogamente, a STFT para um sinal discreto $f[k]$ é definida como
\begin{displaymath} \mbox{STFT}[b, \omega] = \sum_{k=0}^{n-1} g^\ast[k-b] f[k] e^{-2 \pi j \omega k/n } \end{displaymath} (4.8)

Imagine-se $g(t-b)$ como um deslizamento de uma janela através do sinal, e para cada deslocamento de $g$ é calculada a transformada de Fourier (Seção 4.1.1). Esta transformada, que permite uma análise local, depende criticamente da escolha da janela $g(t)$. Quando a janela é determinada, a resolução tempo-freqüência é fixada sobre o plano tempo-freqüência pois a mesma janela é usada para analisar todo o sinal [44].

Vale salientar que o módulo da STFT define o espectrograma da função [10], e pode ser construída em duas dimensões com o tempo no eixo das ordenadas e a freqüência no eixo das abscissas. A amplitude pode ser dada por uma escala de cores na visualização. O espectrograma é definido por

\begin{displaymath} E(b, \omega) = \vert\mbox{STFT}(b,\omega)\vert^2 \end{displaymath} (4.9)


4.2 Mapeamento Numérico de Nucleotídeos

Vários métodos foram utilizados para converter dados categóricos ou simbólicos de seqüências de DNA para serem tratados como seqüências numéricas [1,59]. Esta conversão, ou mapeamento, deve-se à dificuldade de uso direto de dados simbólicos nas técnicas de DSP pois elas têm uma base algébrica totalmente ausente no caso dos dados simbólicos. Um mapeamento de símbolos a números não deve impor uma estrutura matemática que não existe em seqüências de DNA [1]. Existem duas abordagens que podem ser utilizadas para representar numericamente uma seqüência de DNA:

  1. Mapeamento fixo, consiste na atribuição de números inteiros, reais ou complexos, aos quatro caracteres A, C, G e T correspondentes aos tipos de bases presentes na seqüência de DNA (Seção 2.1.1).

    No mapeamento binário [8] são criadas sete seqüências numéricas. Cada seqüência numérica corresponde a uma das sete formas de mapear uma seqüências de DNA baseadas nas características próprias das bases, considerando, por exemplo, as ligações de hidrogênio e se as bases nitrogenadas são purinas ou pirimidinas.

    Na Tabela 4.1 estão representadas as sete regras utilizadas em [8] para as atribuições de valores binários para cada base. Vale salientar que as seqüências obtidas por cada uma dessas regras de mapeamento são independentes, pois estas referem-se a aspectos diferentes da seqüência de DNA, mantendo assim invariância à atribuição numérica.

    Tabela 4.1: Regras para o mapeamento binário de seqüências de DNA. No mapeamento é associada uma seqüência binária para cada regra que indica uma característica ou posição de cada base.
    Regra Atribuição
    A C G T
    1 Ligações de hidrogênio 0 1 1 0
    2 Purina/pirimidina 1 0 1 0
    3 Hibrida 1 1 0 0
    4 Base A 1 0 0 0
    5 Base C 0 1 0 0
    6 Base G 0 0 1 0
    7 Base T 0 0 0 1


    Para o mapeamento por números inteiros [56], reais [40] ou complexos [4] são utilizados números arbitrários ou valores que representam alguma propriedade das bases nitrogenadas como, por exemplo, os potenciais de interação elétron-íon (EIIP, electron-ion interaction potentials) encontrada nas bases. Os autores de [40] analisaram seqüências de DNA em que foram atribuídos valores para cada base como sendo ( A, C, G, T)=(0.1260, 0.1340, 0.0806, 0.1335). A dificuldade com este último mapeamento é, na verdade, a dependência na atribuição de números (inteiros, reais ou complexos) adotada, permitindo que alguma estrutura harmônica relevante seja oculta ou artificialmente criada pela atribuição [1,59]. Considerando, por exemplo, a seqüência periódica ( GTGCGA GTGCGA ...) com a atribuição dos valores ( A, C, G, T)=(1, 0, 0, 0), forma-se uma seqüência numérica de período seis, e para a atribuição de ( A, C, G, T)=(0, 0, 1, 0), forma-se outra de período dois.

  2. Mapeamentos baseados em critérios de otimização [12,49,59], de maneira não arbitrária, e que enfatiza qualquer característica periódica que poderia existir sobre séries estacionárias ou não-estacionárias.

Neste trabalho, utilizamos somente as regras 4 a 7 do mapeamento binário para a atribuição de valores para quatro seqüências, $u_A$, $u_C$, $u_G$ e $u_T$, correspondentes às bases nitrogenadas, em que cada seqüências binária4.2especifica a presença ou não da base A, C, G ou T em uma dada posição da seqüência de DNA. Tal abordagem foi considerada também nos trabalhos [1,4,51]. Por exemplo, a seqüência ATGCTTGACTAGGGCTCAGT e suas correspondentes seqüências binárias são mostradas na Tabela 4.2.

Tabela: Seqüências binárias que representam as posições de A, C, G e T, em uma seqüência de DNA, correspondentes as regras 4 a 7 do mapeamento binário.
Seqüência A T G C T T G A C T A G G G C T C A G T
$u_A$ 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0
$u_C$ 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0
$u_G$ 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0
$u_T$ 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1


Observa-se que um mapeamento fixo inteiro, real ou complexo pode ser obtido baseado no mapeamento binário. Se $a$, $c$, $g$ e $t$ são valores numéricos arbitrários correspondentes às bases A, C, G e T, uma seqüência $s$ de comprimento $N$ pode ser representada como uma combinação linear de suas seqüências binárias $u_A$, $u_C$, $u_G$ e $u_T$ [4], tal que

\begin{displaymath} s[b] = a.u_A[b] + c.u_C[b] + g.u_G[b] + t.u_T[b], \end{displaymath} (4.10)

em que $b$ é uma determinada posição da seqüência. Note que essa representação é tal que $u_A[b]+u_C[b]+u_G[b]+u_T[b]=1$, para qualquer posição $b$. Na Figura 4.1, mostram-se as representações gráficas do mapeamento binário e do mapeamento inteiro de uma seqüência de DNA (Tab. 4.2). Para este último mapeamento consideramos valores atribuídos para ( A, C, G, T)=(1,2,3,4).
Figura: Representação gráfica da seqüência de DNA: ATGCTTGACTAGGGCTCAGT. Em (a) são consideradas quatro seqüências binárias correspondentes às regras 4 a 7 do mapeamento binário. Em (b) considera-se uma seqüência numérica com valores de ( A, C, G, T)=(1,2,3,4).
(a) Mapeamento binário
\includegraphics[width=.4\textwidth]{sequencias_binarias}
(b) Mapeamento inteiro
\includegraphics[width=.4\textwidth]{sequencia_numerica}


4.3 Espectro de Freqüência de DNA

Segundo [4], a transformada discreta de Fourier (4.3) da seqüência (4.10) de comprimento $N$ é definida como
\begin{displaymath} S[k] = \sum_{b=0}^{N-1} s[b]e^{-2 \pi j k b/N }, \quad k=0,\dots,N-1 \end{displaymath} (4.11)

Assim, a seqüência de coeficientes $S$ pode ser expressa como uma combinação linear das transformadas discretas de Fourier das seqüências binárias, dando uma medida do conteúdo da freqüência $k$ definida como
\begin{displaymath} S[k] = a.U_A[k] + c.U_C[k] + g.U_G[k] + t.U_T[k] , \quad k=0,\dots,N-1 \end{displaymath} (4.12)

em que $U_A$, $U_C$, $U_G$ e $U_T$ são as transformadas discretas de Fourier das seqüências binárias pertencentes à seqüência $s$. Essas seqüências representam a freqüência para cada nucleotídeo que, combinadas, dão uma representação quatro-dimensional do espectro de freqüência (Seção 4.1.2) da seqüência de DNA. Portanto, o espectro de freqüência total é definido como [4]
\begin{displaymath} E[k] = \vert U_A[k]\vert^2 + \vert U_C[k]\vert^2 + \vert U_G[k]\vert^2 + \vert U_T[k]\vert^2, \quad k=0,\dots,N-1 \end{displaymath} (4.13)

Observe que, com (4.10) e o resultado de (4.11), temos que

\begin{displaymath} U_A[k] + U_C[k] + U_G[k] + U_T[k] = \left\{ \begin{array}{rl} N, & k = 0 \\ 0, & k \neq 0 \end{array} \right. \end{displaymath}

Como exemplo, nas Figuras 4.2 e 4.3, apresentamos os espectros de freqüência correspondentes a seqüências sintéticas de 600bp: (1) seqüência com periodicidade três de 600bp (Fig. 4.2(a)), (2) seqüência com uma região periódica de 200bp, correspondente às posições 201 a 400 (Fig. 4.2(b)), (3) seqüência com uma região periódica de 100bp, correspondente às posições 251 a 350 (Fig. 4.2(c)), (4) seqüência com uma região periódica de 50bp, correspondente às posições 276 a 325 (Fig. 4.3(d)),

Figura: Espectros de freqüência de seqüências sintéticas de 600bp que contêm regiões com periodicidade três: GCT GCT ... (direita). Representações gráficas das seqüências de DNA (esquerda).
\includegraphics[width=.39\textwidth]{seq7} \includegraphics[width=.4\textwidth]{seq7_spectrum}
(a) Região periódica (1 a 600)
\includegraphics[width=.38\textwidth]{seq3} \includegraphics[width=.4\textwidth]{seq3_spectrum}
(b) Região periódica (201 a 400)
\includegraphics[width=.38\textwidth]{seq5} \includegraphics[width=.4\textwidth]{seq5_spectrum}
(c) Região periódica (251 a 350)

Figura: Espectros de freqüência de seqüências sintéticas de 600bp que contêm regiões com periodicidade três: GCT GCT ... (direita). Representações gráficas das seqüências de DNA (esquerda). (continuação)
\includegraphics[width=.38\textwidth]{seq6} \includegraphics[width=.4\textwidth]{seq6_spectrum}
(d) Região periódica (276 a 325)

Pela constituição dessas seqüências sintéticas, podemos observar que o valor da energia4.3 associada à freqüência três é, geralmente, maior em comparação às outras freqüências. Note, também, que a transformada de Fourier permite realizar uma análise global da seqüência. Note que quanto menor a CDS, menos nítido é o pico de freqüência em relação ao espectro total. Portanto, os valores das energias associadas à freqüência três, correspondentes às regiões com periodicidade três, serão indistintos na medida que a região periódica seja menor.

Na Figura 4.4 apresentamos os espectros de freqüências para uma seqüência periódica de 600bp onde foram percentualmente inseridos dois tipos de ruídos: (1) ruído inclusivo, que corresponde à escolha aleatória de uma determinada porcentagem de bases para depois serem trocados com a mesma probabilidade por A, C, G e T; (2) ruído privativo, que corresponde também à escolha aleatória de uma porcentagem de bases, mas estas podem ser trocadas exclusivamente por outras. Por exemplo, se a base escolhida for A, esta pode ser trocada com igual probabilidade por C, G ou T. A energia correspondente à freqüência três nos espectros de freqüências diminui quando a porcentagem do ruído é maior (Fig. 4.4(a)), mas no caso do ruído privativo próximo a 100%, a energia nessa freqüência é maior do que as outras freqüências, pois a probabilidade de troca de uma base selecionada, por outra que não seja a mesma, é de 1/3 (Fig. 4.4(b)).

Mostramos alguns exemplos de espectros de freqüências de seqüências de DNA correspondentes a uma CDS de 6885bp (região 86474-93358) (Fig. 4.4(c)), e uma região não-codificante de 1389bp (Fig. 4.4(d)) do genoma de Arabidopsis thaliana com número de acesso GenBank NC_000932. Em todos os exemplos mostrados nesta seção, com exceção das seqüências correspondente à região não-codificante (Fig. 4.4(d)), a energia presente na freqüência três nos espectros de freqüências demonstram a existência da TBP presente nas CDSs (Seção 2.3). Entretanto, a energia associada à periodicidade três depende do tamanho da seqüência analisada [11]. É de esperar-se uma energia alta quando a seqüência analisada possua uma alta periodicidade latente de três bases. Na seção seguinte realizamos um estudo aprofundado da periodicidade nas seqüências de DNA e em particular da TBP.

Figura 4.4: Espectro de freqüências de seqüências. Em (a) e (b) mostram-se os coeficientes da transformada de Fourier para um conjunto de seqüências sintéticas de 600bp em que foram percentualmente inseridos dois tipos de ruído. Em (c) e (d) mostram-se os coeficientes da transformada de Fourier para seqüências reais.
(a) Sintética com ruído inclusivo
\includegraphics[width=.4\textwidth]{seq4A_spectrum}
(b) Sintética com ruído privativo
\includegraphics[width=.4\textwidth]{seq4B_spectrum}
(c) CDS de A. thaliana
\includegraphics[width=.38\textwidth]{regiao_codificante}
(d) Região inter-gênica de A. thaliana
\includegraphics[width=.4\textwidth]{regiao_no_codificante}


4.4 Análise de Periodicidade de DNA

Neste trabalho usamos dois tipos de conjuntos de seqüências de DNA (Apêndice A) para avaliar os métodos estudados. O primeiro tipo trata de seqüências criadas sinteticamente, enquanto o segundo corresponde a conjuntos de seqüências reais de eucariotos usados para avaliar programas computacionais de identificação de genes.

Nesta seção, apresentamos para cada tipo de conjunto, as primeiras 23 estimativas inteiras de periodicidades, isto é, estimativas da periodicidade 2 a 24 das regiões codificantes (que simulam TBP) e regiões não-codificantes (regiões inter-gênicas e, no caso dos organismos eucariotos, íntrons). Observamos, para faixas maiores de periodicidade, um comportamento similar nas estimativas destas periodicidades, isto é, a energia associada à freqüência três nas regiões periódicas (CDSs) é sempre maior que as das outras freqüências. Esse fato motiva o desenvolvimento de métodos de identificação de CDSs com base na periodicidade.

Para o cálculo dos valores de periodicidade, nesta seção, utilizamos somente os coeficientes da transformada de Fourier (Seção 4.1.1) de cada região nas seqüências de DNA. Em [20,47] encontra-se uma descrição detalhada dos métodos comuns para o cálculo de periodicidade em seqüências de DNA.


4.4.1 Periodicidade em Seqüências Sintéticas

As estimativas de periodicidade das seqüências sintéticas sintética1_0 e sintética2_0 (Apêndice A.1) são representadas nas Figuras 4.5(a) e 4.5(b). A seqüência sintética1_0 contém regiões periódicas de 2 até 6, sendo exatamente nessas periodicidades que as energias são maiores às dos outros não considerados na seqüência sintética. Já para a seqüência sintética2_0, que contém nove regiões periódicas de três bases (que simulam TBP), a energia associada à periodicidade três é maior as das outras regiões. Observemos que, para as regiões que não tem alguma periodicidade (que simulan regiões não-codificantes), nenhum comportamento similar é encontrado nas medidas de periodicidade.

No Apêndice B, estão representadas as periodicidades de algumas das seqüências sintéticas sintética2_XA e sintética2_XB em que as bases pertencentes às regiões periódicas foram alteradas com ruído.

Figura 4.5: Periodicidades estimadas para seqüências de DNA. Foram calculadas as periodicidades 2 a 24 das regiões codificantes (que simulam TBP) e regiões não-codificantes (regiões inter-gênicas e, no caso dos organismos eucariotos, íntrons).
[Seqüência sintética1_0]\includegraphics[width=.4\textwidth]{sintetica1_0} [Seqüência sintética2_0]\includegraphics[width=.4\textwidth]{sintetica2_0}
[Conjunto de seqüências reais A]\includegraphics[width=.4\textwidth]{conjunto_a} [Conjunto de seqüências reais B]\includegraphics[width=.4\textwidth]{conjunto_b}


4.4.2 Periodicidades em Seqüências Reais

Na Figuras 4.5(c) e 4.5(d) mostramos a representação das periodicidades estimadas para os éxons, íntrons e regiões inter-gênicas para conjuntos de seqüências reais (Apêndice A.2). Observemos que os éxons apresentam uma energia associada às CDSs maior em comparação às outras energias das periodicidades estimadas. Esta estimativa demonstra a existência da TBP presente somente nas CDSs (Seção 2.3).


4.5 Identificação de CDSs

As pesquisas sobre DSP demonstraram que uma análise de Fourier (e também Wavelet) pode ser de grande ajuda na descrição da estrutura das seqüências de DNA [13,34,62,63]. A seguir, apresentamos uma visão geral dos métodos de DSP utilizadas para a identificação de CDSs.

S. Tiwari, em [51], para uma seqüência de comprimento $N$, definiu quatro coeficientes normalizados na freqüência três4.4, isto é, o coeficiente da STFT na posição $N/3$, como

$\displaystyle A=\frac{1}{N}U_{A}\Big[\frac{N}{3}\Big], C=\frac{1}{N}U_{C}\Big[\... ...=\frac{1}{N}U_{G}\Big[\frac{N}{3}\Big], T=\frac{1}{N}U_{T}\Big[\frac{N}{3}\Big]$     (4.14)

tal que,
\begin{displaymath} W = \vert A\vert^2 + \vert C\vert^2 + \vert G\vert^2 + \vert T\vert^2, \end{displaymath} (4.15)

é definido como um identificador de CDSs4.5, com $A+C+G+T=0$. $U_A$, $U_C$, $U_G$ e $U_T$ representam a STFT para sinais discretos (Seção 4.1.4) das seqüências binárias $u_A$, $u_C$, $u_G$ e $u_T$ associadas a seqüência de DNA (Seção 4.2).

Como exemplo, apresentamos os valores dos coeficientes $W$ para três seqüências de DNA:

  1. Seqüência sintética1_0 (Apêndice A.1) de 6000bp utilizando para o calculado das STFTs variações do tamanho de janela de 2bp a 400bp (Fig. 4.6(a)). Observemos que para as regiões com periodicidade três os coeficientes são maiores em comparação às das outras regiões (com periodicidade dois, quatro, cinco e seis). Observemos, também, que em grande parte as energias para a região de periodicidade seis são consideráveis pois esta periodicidade é múltiplo de três. Entretanto, todos estes coeficientes variam de acordo com o tamanho da janela utilizada. Uma boa aproximação para a identificação de regiões com periodicidade três para esta seqüência foi obtida usando uma janela de 21bp (Fig. 4.6(b)), pois a periodicidade nessas regiões é latente (Seção 2.3), isto é, a periodicidade é uniforme. Resultados similares foram obtidos para tamanhos de janela de 9 a 200.

  2. Seqüência sintética2_0 (Apêndice A.1) de 10000bp utilizando para o cálculo das STFTs variações do tamanho de janela de 2bp a 400bp (Fig. 4.6(c)). Esta seqüência sintética contém nove regiões com periodicidade três de diferentes comprimentos. Observemos que, para essas nove regiões, os coeficientes são maiores em comparação às regiões que contém bases aleatórias. Igualmente, como no caso da seqüência sintética1_0, estes coeficientes são dependentes do tamanho de janela utilizada no cálculo, pois são obtidas energias diferentes para tamanhos de janela diferentes. Na Figura 4.6(d) apresentamos uma aproximação para a identificação dessas regiões usando um tamanho de janela de 21bp.

  3. Gene F56F11.4 de C. elegans de 8000bp cujos éxons são mostrados na Tabela 4.3, incluindo sua posição relativa no gráfico. Para o cálculo dos coeficientes utilizamos arbitrariamente variações de tamanho de janela de 2bp a 500bp (Fig 4.6(e)). Esta análise local permite identificar regiões que contenham TBP, mas os resultados dessa identificação são sempre dependentes do tamanho utilizado de janela na análise. Em [4], a identificação dos éxons usando uma janela de 351bp foi apresentada. Observemos que os coeficientes correspondentes às regiões dos quatro últimos éxons são maiores comparando-se com as das outras regiões. Podemos presumir que o primeiro éxon apresenta pouca TBP ou o tamanho de janela utilizada nessa análise não é adequada. Resultados similares foram obtidos mediante tamanhos de janela de 300bp a 400bp.


Tabela 4.3: Éxons do gene F56F11.4.4 de C. elegans. NCBI, número de acesso AF099922 e região 7021-15020.
Posição relativa Bases Reading frame
928-1039 112 2
2528-2857 330 2
4114-4377 264 1
5465-5644 180 2
7255-7605 351 1


Figura 4.6: Coeficientes $W$ estimados, para seqüências de DNA, com um conjunto de tamanhos de janela (esquerda), e com um tamanho de janela determinado (direita).
[sintética1_0 com janelas de 2 a 400bp]\includegraphics[width=.38\textwidth]{tiwari_s1_janelas} [sintética1_0 com janela de 21bp]\includegraphics[width=.38\textwidth]{tiwari_s1_janela21}
[sintética2_0 com janelas de 2 a 400bp]\includegraphics[width=.38\textwidth]{tiwari_s2_janelas} [sintética2_0 com janela de 21bp]\includegraphics[width=.38\textwidth]{tiwari_s2_janela21}
[Gene F56F11.4 com janelas de 2 a 500bp]\includegraphics[width=.38\textwidth]{tiwari_ce_janelas} [Gene F56F11.4 com janela de 351bp]\includegraphics[width=.38\textwidth]{tiwari_ce_janela351}

Em um trabalho subseqüente de D. Anastassiou [4], define-se

\begin{displaymath} W= \vert a.A + c.C + g.G + t.T\vert^2 \end{displaymath} (4.16)

como um identificador de CDSs, tal que $a$, $c$, $g$ e $t$ são números complexos arbitrários com $A+C+G+T=0$. Para maximizar a capacidade discriminatória, estes valores estatísticos devem ser obtidos de outras seqüências similares ou homólogas4.6cuja codificação seja comprovada, isto é, de éxons anotados. Usando uma seqüência sintética aleatória do mesmo tamanho da seqüência cujas CDSs são conhecidas, pode-se obter os coeficientes $A_R$, $C_R$, $G_R$ e $T_R$; e pelas definições da Seção 4.2, as seqüências A, C, G e T representam um conjunto redundante, um dos coeficientes podendo ter o valor zero. Em [4] atribuiu-se o coeficiente $c=0$. Assim $W = \vert a.A+ g.G + t.T\vert^2$. O problema se reduz a achar números complexos $a$, $g$, e $t$ que maximizem a quantidade
\begin{displaymath} p(a,g,t) = \frac{ E\{\vert aA+gG+tT\vert\} - E\{\vert aA_... ... { std(\vert aA+gG+tT\vert)+ std(\vert aA_R+gG_R+tT_R\vert) } \end{displaymath} (4.17)

com as condições $ E\{\arg\{a.A+t.T+g.G\}\}=0$ e $\vert a\vert+\vert t\vert+\vert g\vert=1$.

Para os genes do cromossomo XVI de S. cerevisiae Anastassiou estimou [4]: $a=0.10+0.12j$, $c=0$, $g=0.45-0.19j$, $t=-0.30-0.20j$. Na Figura 4.7 apresentamos os valores dos coeficientes $W$ (Eq. 4.16) para o gene anteriormente tratado. Vemos que o resultado é significativamente melhor que o método usado em (Eq. 4.15). Pois os coeficientes correspondentes à região do primeiro éxon do gene F56F11.4 (Tab. 4.3) são comparáveis aos coeficientes dos outros éxons. No entanto, a desvantagem deste método é que precisa-se de uma outra seqüência com CDSs conhecidas para a obtenção das constantes $a$, $c$, $g$ e $t$.

Figura 4.7: Coeficientes $W$, segundo [4], estimados para o gene F56F11.4, com um conjunto de tamanhos de janela (esquerda), e com um tamanho de janela determinado (direita).
[Com janelas de 2 a 500bp]\includegraphics[width=.4\textwidth]{anastassiou_ce_janelas} [Com janela de 351bp]\includegraphics[width=.4\textwidth]{anastassiou_ce_janela351}

Vaidyanathan [57] propôs a utilização de filtros digitais4.7para a identificação de CDSs utilizando como base a TBP presente nas CDSs. Basicamente, esta técnica consiste nos seguintes passos:

Este método em grande parte elimina o ruído presente nos métodos anteriores, mas a desvantagem é a perda de resolução. Em [57] apresentam-se diferentes filtros e mostram-se resultados similares à identificação de CDSs usando a Equação (4.15).

Os métodos de DSP baseados na transformada de Fourier [4,51] e filtros digitais [57] não apresentam, atualmente, formulações bastante elaboradas devido à dependência do tamanho de janela que deve ser definida previamente para analisar localmente uma dada região de DNA. Quanto maior for o tamanho da janela, maior será o número coeficientes relevantes, e maior o custo computacional gasto (Figs 4.6 e 4.7). Vale salientar que estes métodos consideram somente a energia associada à periodicidade três para a identificação de CDSs.

A definição do tamanho da janela a ser utilizada na análise das seqüências de DNA é crítica para a identificação das CDSs [33], pois compromete fortemente a resolução e o resultado. Com o objetivo de reduzir a dependência ao tamanho, surgiu uma outra classe de métodos para a identificação de CDSs. Estes métodos exploram fortemente o mecanismo de mudança de tamanho da janela, utilizando transformadas em wavelets (tratados na Seção 5.1). Na atualidade, valores ótimos para o tamanho de janela e/ou escala são encontrados através de experimentação [33].

Assim, existem estudos preliminares na utilização de transformadas em wavelets para a identificação de CDSs. Em [40], utilizaram o mapeamento numérico fixo baseado no EIIP (Seção 4.2), atribuindo valores correspondentes aos potenciais das bases ( A, C, G, T)=(0.1260, 0.1340, 0.0806, 0.1335). As wavelets utilizadas foram as Coiflets e Daubechies para decompor o sinal.

Todos os métodos de análise tempo-freqüência, revisados nesta dissertação, são independentes das propriedades estruturais biológicas existentes nas seqüências de DNA. Em [12], os autores utilizaram uma transformada em wavelet adaptativa4.8, chamada bionic para a identificação de CDSs. A wavelet bionic baseia-se no modelo auditivo humano, onde a resolução tempo-freqüência pode ser ajustada adaptativamente e a módulo dos coeficientes associada as freqüências pode ter uma melhor distribuição.

Este método permite tanto a utilização do mapeamento binário fixo, como do mapeamento baseado em critérios de otimização. Nos dois tipos de mapeamento, é utilizado um vetor de pesos associado à seqüência de DNA. O mapeamento baseado no critério de otimização, refere-se ao processamento iterativo das seqüências binárias conjuntamente com o vetor de pesos. Este vetor é modificado pelos módulos dos coeficientes da transformada em wavelets de uma iteração prévia. A maximização da distribuição da energia (os módulos dos coeficientes) é realizada mediante o processamento das seqüências numéricas pela transformada em wavelet bionic. Os maiores módulos dos coeficientes associados às seqüências analisadas foram as correspondentes à freqüência próxima a 0.33Hz [12].

Vários outros estudos foram realizados, como o uso de técnicas de análise espectral, para identificar periodicidades latentes e características de interesse biológico [50]. Em seqüências de DNA foram utilizados transformadas em wavelets para explorar a complexidade da composição de bases [6], e visualização de padrões regulares [18]. Comparações de seqüências de proteínas, baseadas na transformada em wavelets, estão descritas em [52].


4.6 Medidas de Acurácia de Identificação de Genes

As medidas de acurácia no nível dos nucleotídeos, descritas por M. Burset e R. Guigó [9], propõem uma forma de comparação de regiões identificadas, mediante procedimentos computacionais, com CDSs conhecidas biologicamente, isto é, regiões cujas posições dos éxons, nos genes, são conhecidas. Portanto, estas medidas servem para comparar o desempenho dos programas computacionais de identificação de genes (Seção 2.4).

A medição de regiões identificadas contra CDSs conhecidas é feita mediante contagem de nucleotídeos correspondentes aos (1) verdadeiros positivos (TP, true positive), que são regiões corretamente identificadas, (2) falsos positivos (FP, false positive), que são regiões identificadas erroneamente, (3) verdadeiros negativos (TN, true negative), que são regiões corretamente não identificadas, e (4) falsos negativos (FN, false negative), que são regiões não identificadas (Fig. 4.8). Foram propostas duas medidas de acurácia baseadas nas taxas de ocorrências de sensibilidade e especificidade.

Figura 4.8: Os quatro possíveis resultados de regiões identificadas contra CDSs conhecidas.
\includegraphics[width=.8\textwidth]{medidas_exatidao}

Um programa computacional é considerado exato se sua Sn e Sp são simultaneamente altas. Assim, a medida de exatidão que combina a Sp e Sp é chamada de coeficiente de correlação (CC),


\begin{displaymath} CC = \frac{TP.TN-FN.FP}{\sqrt{(TP+FN)(TN+FP)(TP+FP)(TN+FN)}} \end{displaymath} (4.20)

Os valores dos CC vão de -1, quando a identificação é incorreta, a +1, quando a identificação é correta [9,39].

Uma recente avaliação de alguns programas de identificação de genes foi realizada em [37,45]. Outras medidas de acurácia, no nível de éxons e de proteínas, podem ser revisadas em [9]. Vale salientar que todas estas medidas não estão baseadas em componentes de desempenho como o tempo de execução ou requerimentos de memória dos programas computacionais avaliados.

Um script em PERL $^{\textrm{\scriptsize\texttrademark}}$ para estimação das medidas de acurácia, de conjuntos de seqüências identificadas, está disponível no endereço http://www.vision.ime.usp.br/~jmena/DSPgenomics/.


5. Identificação de CDSs através da MMT

Como visto no capítulo anterior, a principal desvantagem dos métodos de DSP existentes para identificação de CDSs é a dependência da definição do tamanho da janela de análise. Este problema é resolvido no método apresentado nesta dissertação.

Neste capítulo, revisamos brevemente as definições básicas da análise em wavelets e apresentamos a definição da MMT proposta. Em seguida, descrevemos o novo método desenvolvido para a identificação de CDSs em seqüências de DNA onde a periodicidade de três bases seja latente, de maneira a contornar esse problema. Consideramos este método a principal contribuição da dissertação.


5.1 Análise em Wavelets

A transformada em wavelets permite uma análise tempo-escala de um sinal, que consiste na sua representação em termos de sinais simples construídas por translações e dilatações de uma wavelet de análise $\psi$5.1. A transformada em wavelets contínua de um sinal $u$ é calculada a partir do produto interno do sinal com o conjugado complexo da wavelet de análise $\psi: \mathcal{R} \rightarrow \mathcal{C}$ [10]:

\begin{displaymath} U(b,a) = \frac{1}{\sqrt{a}}\int_{-\infty}^{\infty} u(t) \psi^*\Big(\frac{t-b}{a}\Big) dt, \end{displaymath} (5.1)

em que $a,b \in \mathcal{R}$. $a>0$, é o coeficiente de escala que permite a compressão ou expansão da função wavelet, sendo inversamente relacionada à freqüência, $b$ é o coeficiente que permite a sua translação através do eixo do tempo (ou posição), e $\psi(t)$ é a função base wavelet. O fator $\frac{1}{\sqrt{a}}$ é usado para normalização da energia.

Para sinais discretos, a transformada em wavelets do sinal $u$, é definida como

\begin{displaymath} U(b,a) = 2^{-\frac{a}{2}} \sum_k u(k) \psi(2^{-a}k-b), \end{displaymath} (5.2)

em que $a$ e $b$ são valores discretos, e a função discreta $\psi$ pode ser tomada como uma versão amostrada da contraparte contínua. Veja [10,14], para uma descrição maior dos tipos de transformada em wavelets.

A wavelet de análise $\psi$ é geralmente escolhida para ser bem localizada em tempo e freqüência. Esta função pode ser real ou complexa, resultando também em uma transformada real ou complexa. Na análise do sinal, nenhuma escala é privilegiada pois a mesma função $\psi$ é utilizada, em diversas escalas. Portanto a transformada mantém uma resposta fortemente dependente da função $\psi$ [10].

A transformada em wavelets permite calcular os coeficientes dos espectros de freqüência para cada posição de um sinal específico, isto é, a energia em função de posição e freqüência. Os espectros de freqüência derivados da transformada de Fourier (Seção 4.1.1), mantêm energia como função de freqüência, onde toda a informação espacial é oculta ou perdida. Já no caso da STFT (Seção 4.1.1) esta informação é obtida, mas dependente do tamanho da janela. Esta vantagem sobre a transformada de Fourier e STFT é alcançada através do uso das funções wavelets [44]. Analogamente ao espectrograma (Seção 4.1.4), as magnitudes da transformada em wavelets definem o escalograma da função [44]. O escalograma será explorado pelo método de identificação de CDSs introduzido neste trabalho e tratado na Seção 5.3.


5.2 Transformada Modificada de Morlet

A primeira wavelet de análise estudada, e comumente usada, no contexto da teoria das wavelets foi a wavelet de Morlet ou Gaussiana modulada. A função de análise de Morlet, como definida em [10], permite variar o desvio padrão da Gaussiana juntamente com a freqüência da exponencial complexa,
\begin{displaymath} \psi_M(t) = e^{j \omega_0 t} e^{-\frac{t^2}{2}} \end{displaymath} (5.3)

em que $w_0$ é a freqüência de $\psi$ (Fig. 5.2(a)). Por outro lado, na função de análise de Gabor,
\begin{displaymath} g(t,a) = e^{j a t} e^{-\frac{t^2}{2}} \end{displaymath} (5.4)

varia-se a freqüência da exponencial complexa, mantendo constante o desvio padrão da Gaussiana [15] (Fig. 5.2(b)). A função de análise de Morlet e a de Gabor são particularmente apropriadas para a análise de padrões periódicos locais, pois são bem localizadas no domínio do tempo e da freqüência [15]. Essas duas abordagens permitem analisar sinais mediante a variação da freqüência da exponencial complexa. Portanto, toda região periódica existente no sinal terá coeficientes de transformação $U(b,a)$ proporcionais ao comprimento do período da região analisada. Isso sugere que regiões com diversas freqüências podem ser analisadas.

No presente estudo, onde somente estamos interessados na análise de uma freqüência específica5.2, as funções de análise anteriores não são completamente adequadas pois variam as freqüências da exponencial complexa na sua transformação. Aqui definimos uma modificação da função de análise de Morlet para analisar um sinal em uma dada freqüência fixa (freqüência da exponencial complexa constante), e de escala variável.

Segundo (5.3), temos que

\begin{displaymath} \psi\left(\frac{t-b}{a}\right) = e^{ j \omega_0 (\frac{t-b}{a})} e^{-\frac{\left(\frac{t-b}{a}\right)^2}{2}} \end{displaymath} (5.5)

Assim, em (5.1), a transformada de um sinal $u$ em wavelets de Morlet será dada por
\begin{displaymath} U(b,a) = \frac{1}{\sqrt{a}}\int_{-\infty}^{\infty} u(t) ... ...rac{t-b}{a})} e^{-\frac{\left(\frac{t-b}{a}\right)^2}{2}} dt \end{displaymath} (5.6)

em que $w_0$ é a freqüência de $\psi$, $a$ o coeficiente da escala, e $b$ o coeficiente de translação através do eixo do tempo. A MMT também utiliza uma função Gaussiana multiplicada por uma exponencial complexa. Esta função, através do parâmetro de escala $a$, permite variar o desvio padrão da Gaussiana, mantendo constante a freqüência da exponencial complexa, ou seja,
\begin{displaymath} U(b,a) = \frac{1}{\sqrt{a}}\int_{-\infty}^{\infty} u(t) e^{j \omega_0 (t-b)} e^{-\frac{(t-b)^2}{2a^2}} dt \end{displaymath} (5.7)

Portanto, a função de análise $\psi$ da MMT é definida como
\begin{displaymath} \psi_{MM}(t,a) = e^{j \omega_0 t} e^{-\frac{t^2}{2a^2}} \end{displaymath} (5.8)

cuja transformada de Fourier é
\begin{displaymath} \Psi_{MM}(\omega,a) = \sqrt{2\pi} e^{-a^2\frac{({\omega-\omega_0})^2}{2}} \end{displaymath} (5.9)

Note que a freqüência de $\psi_{MM}$ varia de acordo com o valor definido por $\omega_0$. No caso discreto, se consideramos um tamanho arbitrário de $N$ pontos para $\psi_{MM}$, e $\omega_0=N/k$, para um real positivo $k$, $\psi_{MM}$ terá uma periodicidade que oscila $k$ vezes.

Na Figura 5.1 apresentamos três representações de $\psi_{MM}$, e suas transformadas de Fourier, considerando arbitrariamente $\omega_0=6.66$ e $t$ no intervalo $(-10,10)$. Os valores das escalas são os correspondentes a 0.5, 1 e 4. Como $\omega_0=6.66=20/3$, espera-se que a $\psi_{MM}$ oscile a cada três pontos. A Figura 5.2 ilustra graficamente as diferenças entre as funções de análise de Gabor, Morlet, e Morlet modificado, com valores arbitrários de $\omega_0$, $a$ e $b$. Observe-se que, dessas três funções, na função de análise da modificação de Morlet, a freqüência é mantida constante.

Finalmente, é importante destacar que, atualmente, desconhecemos se verdadeiramente a MMT é uma transformada em wavelets.

Figura 5.1: Representações da transformada modificada de Morlet (esquerda) e suas correspondentes transformadas de Fourier (direita). Foram considerados $\omega _0=6.6$, $t$ no intervalo $(-10,10)$ e escalas $a$ de 0.5, 1 e 4.
\includegraphics[width=.4\textwidth]{morlet_a05W20e3} \includegraphics[width=.4\textwidth]{morlet_a05W20e3FT}
(a) $a=0.5$
\includegraphics[width=.4\textwidth]{morlet_a1W20e3} \includegraphics[width=.4\textwidth]{morlet_a1W20e3FT}
(b) $a=1$
\includegraphics[width=.4\textwidth]{morlet_a4W20e3} \includegraphics[width=.4\textwidth]{morlet_a4W20e3FT}
(c) $a=4$

Figura 5.2: Representações das funções de análise. Em (a) varia-se a freqüência da exponencial complexa, mantendo constante o desvio padrão da Gaussiana. Em (b) varia-se o desvio padrão da Gaussiana juntamente com a freqüência da exponencial complexa. Em (c) varia-se o desvio padrão da Gaussiana, mantendo constante a freqüência da exponencial complexa.
\includegraphics[width=0.30\textwidth]{gabor_1} \includegraphics[width=0.30\textwidth]{morlet_1} \includegraphics[width=0.30\textwidth]{mmorlet_1}
\includegraphics[width=0.30\textwidth]{gabor_2} \includegraphics[width=0.30\textwidth]{morlet_2} \includegraphics[width=0.30\textwidth]{mmorlet_2}
\includegraphics[width=0.30\textwidth]{gabor_3} \includegraphics[width=0.30\textwidth]{morlet_3} \includegraphics[width=0.30\textwidth]{mmorlet_3}
(a) Gabor (b) Morlet (c) Morlet modificado


5.3 Método para a Identificação de CDSs através da MMT

Na Seção 4.5, revisamos métodos de DSP utilizados na identificação de CDSs que precisam da definição prévia de algum critério para adotar um tamanho de janela que seja apropriado na análise de toda a seqüência de DNA. Assim, os resultados obtidos dessa análise são dependentes do tamanho de janela utilizado. Por outro lado, os métodos que reduzem a dependência ao tamanho de janela, exploram a transformação em wavelets, mas todos esses estudos ainda estão em uma etapa preliminar. Tais métodos apresentam uma verificação visual dos resultados obtidos, pois a grande dificuldade na identificação de CDSs, mediante a procura de periodicidade, é a determinação das fronteiras entre CDSs e regiões não-codificantes de proteínas. Esta dificuldade deve-se à transformada utilizada e em grande parte à periodicidade de três bases de baixa latência existentes em algumas CDSs.

Nesta seção, descrevemos um novo método utilizando a MMT para a identificação de CDSs, onde a periodicidade de três bases seja latente. O método divide o processo automático de identificação em quatro blocos importantes: (1) mapeamento de seqüências de DNA em quatro seqüências binárias, (2) aplicação da MMT sobre cada seqüência binária, (3) projeção dos módulos dos coeficientes normalizados da MMT, e (4) limiarização dos coeficientes de projeção, para a detecção das possíveis fronteiras entre as CDSs. Na Figura 5.3 mostramos um diagrama de blocos do método proposto.

Figura 5.3: Diagrama de blocos do novo método utilizando a MMT para a identificação de CDSs onde a periodicidade de três bases seja latente. Cada bloco representa uma operação e cada seta o fluxo da informação.
\includegraphics[width=0.75\textwidth]{metodo_mmt}


5.3.1 Mapeamento

Utilizamos as primeiras quatro regras do mapeamento fixo binário (Seção 4.2), para o mapeamento de seqüências de DNA em seqüências numericamente tratáveis.

Cada seqüência binária representa as posições de cada base nitrogenada na seqüência de DNA. Com este mapeamento, não mantém-se dependência sobre alguma atribuição numérica arbitrária. Na Tabela 4.2, apresentamos um exemplo do mapeamento binário para uma seqüência de DNA. Denotamos as seqüências binárias associadas a seqüências de DNA $s$ como $u_A$, $u_C$, $u_G$, e $u_T$ correspondentes às bases A, C, G, e T, como descrito na Equação (4.10).


5.3.2 Aplicação da MMT

No passo seguinte, para um tamanho arbitrário de $N$ pontos, a MMT com $\omega_0=N/3$5.3 e diferentes escalas, é calculada para as seqüências binárias associadas à seqüência de DNA. A definição de $\omega_0=N/3$ sugere uma periodicidade três em (5.8), como descrita na Seção 5.2.

A MMT para cada seqüência binária $u_A$, $u_C$, $u_G$ e $u_T$, é dada por:

$\displaystyle U_A(b,a) = \frac{1}{\sqrt{a}}\int_{-\infty}^{\infty} u_A(t) \psi^*_{MM}(t-b,a)dt$     (5.10)
$\displaystyle U_C(b,a) = \frac{1}{\sqrt{a}}\int_{-\infty}^{\infty} u_C(t) \psi^*_{MM}(t-b,a)dt$     (5.11)
$\displaystyle U_G(b,a) = \frac{1}{\sqrt{a}}\int_{-\infty}^{\infty} u_G(t) \psi^*_{MM}(t-b,a)dt$     (5.12)
$\displaystyle U_T(b,a) = \frac{1}{\sqrt{a}}\int_{-\infty}^{\infty} u_T(t) \psi^*_{MM}(t-b,a)dt$     (5.13)

em que, os sinais resultantes $U_A(b,a)$, $U_C(b,a)$, $U_G(b,a)$ e $U_T(b,a)$ representam os coeficientes da transformação utilizando $\psi_{MM}$.

A fim de manter uma medida comparável em todas as escalas, os módulos ao quadrado dos coeficientes da transformação são multiplicados por um fator de normalização proporcional à escala utilizada. Esta normalização deve-se ao fato que para escalas maiores os coeficientes correspondentes às regiões com TBP latente são menores. Estes coeficientes são denotados como os espectros da MMT, tal que

$\displaystyle m_A(b,a) = a \left\vert U_A(b,a)\right\vert^2$     (5.14)
$\displaystyle m_C(b,a) = a \left\vert U_C(b,a)\right\vert^2$     (5.15)
$\displaystyle m_G(b,a) = a \left\vert U_G(b,a)\right\vert^2$     (5.16)
$\displaystyle m_T(b,a) = a \left\vert U_T(b,a)\right\vert^2$     (5.17)

em que $b$ representa a posição dos sinais, e $a$ a escala utilizada.

As Equações (5.14)-(5.17) representam medidas parciais da energia associada à transformação. Conseqüentemente, a medida espectral total da seqüência de DNA é dada por:

\begin{displaymath} M(b,a) = m_A(b,a) + m_C(b,a) + m_G(b,a) + m_T(b,a) \end{displaymath} (5.18)

Uma vez que a seqüência de DNA seja representada pela transformada multi-escala, diferentes aproximações podem ser consideradas afim de extrair informações dela [15]. Assim, esta transformação pode ser aplicada para um intervalo grande de escalas $a$, exponencialmente espaçadas e definidas a priori, para analisar as seqüências binárias. No Capítulo 6, apresentamos os melhores resultados para valores de escala no intervalo 0.05 a 0.5. Estes valores ótimos foram encontrados através de experimentação.

No método, quando o mapeamento fixo é utilizado para converter uma seqüência de DNA em quatro seqüências binárias, é intrinsecamente assumido que todas as bases são independentes pois cada seqüência binária é tratada de forma independente. Entretanto, seqüências genômicas, incluídas as seqüências de DNA, são criadas e mantidas por complicados processos biológicos [2], existindo uma interação entre bases adjacentes. Esta interação é geralmente estimada mediante correlações de seqüências de DNA [5,28]. Os coeficientes normalizados totais $M(b,a)$, para uma escala $a$, agrupa os coeficientes associados às transformações das seqüências binárias mantendo, em parte, uma interação entre elas.


5.3.3 Projeção dos Coeficientes da MMT

Os coeficientes do espectrograma da MMT (5.18) são projetados no eixo das posições, a fim de representar as possíveis CDSs com TBP. Para uma seqüência de comprimento $N$, os coeficientes de projeção que definem o identificador proposto de CDSs, serão representados por uma somatória dos coeficientes em todas as escalas, como

\begin{displaymath} M_p(b) = \sum_{a} M(b,a) \end{displaymath} (5.19)

para todo $b$ entre 1 e $N$. Existe uma forte relação da projeção $M_p$ com a transformada de Fourier, pois a informação da escala é perdida durante a projeção. Entretanto, na transformada de Fourier, a informação de tempo é perdida. As projeções no eixo das escalas revelam qual delas mantém maior energia através das posições,
\begin{displaymath} M_s(a) = \sum_{b=1}^{N} M(b,a) \end{displaymath} (5.20)

para todas as escalas $a$.

Estas duas projeções são uma maneira simples de extrair informação da transformada multiescala MMT nos eixos [15]. Tomando um exemplo dos coeficientes de projeção, é razoável concluir que se duas seqüências têm CDSs com TBP similar, então estes coeficientes devem também ser similares.


5.3.4 Limiarização dos Coeficientes de Projeção

Uma parte importante na identificação de CDSs é a determinação das fronteiras entre CDSs e regiões não codificantes de proteínas. O processo da limiarização, neste método, corresponde a uma tentativa de estabelecimento dessas fronteiras, em que são substituídos por zero qualquer coeficiente menor que um valor limite, mantendo constantes os coeficientes restantes.

A limiarização sobre $M_p$, na Equação (5.19), é uma maneira de eliminar detalhes ``não importantes'' considerados como ruído, ou como regiões com TBP com baixa latência. Consideramos um limiar percentual [58] em que são selecionados uma porcentagem das magnitudes dos coeficientes de projeção. O conjunto dos menores valores, em termos absolutos, são substituídos por zero. Portanto, uma aproximação das CDSs são as regiões isoladas cuja magnitudes $M_p$ são maiores que zero.


6. Resultados Experimentais

Neste capítulo, discutimos alguns resultados experimentais obtidos com o método proposto para a identificação de CDSs onde a periodicidade de três bases seja latente (Seção 5.3). Apresentam-se experimentos comparativos de identificação de CDSs através da MMT e da STFT, em seqüências sintéticas e reais. Conjuntos de seqüências de DNA (Apêndice A) também foram utilizados na experimentação.

Mostramos nas figuras associadas à análise de cada seqüência, os coeficientes da MMT normalizados (Eq. 5.18), os coeficientes da projeção no eixo das posições da MMT (Eq. 5.19), e os coeficientes normalizados da STFT (Eq. 4.15) com comprimentos de janela de 200bp e 400bp. Mostramos a análise para cada seqüência binária associada às bases A, C, G e T. A união, que indica uma medida total da identificação, corresponde à somatória de todos os coeficientes das transformadas. As linhas pontilhadas verticalmente indicam par a par as posições das CDSs biologicamente conhecidas.

Geralmente, dos coeficientes de projeção no eixo das posições, as magnitudes associadas às CDSs são comparavelmente maiores que das outras regiões na seqüência de DNA por terem TBP latente, salvo exceções as quais serão discutidas nas seguintes seções. Observaremos que essa periodicidade não está presente em todos os coeficientes parciais de projeção.

No método de identificação de CDSs através da MMT utilizamos 40 escalas, exponencialmente espaçadas, no intervalo 0.05 e 0.5. Entretanto, no método de identificação de CDSs através da STFT consideramos arbitrariamente comprimentos de janelas de 200bp e 400bp, correspondentes aos valores aproximados da média e do desvio padrão dos comprimentos nos éxons dos conjuntos A e B (Tabelas A.3 e A.6).

Para comparar os métodos tratados utilizamos a mesma limiarização sobre os coeficientes obtidos depois da projeção, na MMT, ou da somatória dos coeficientes normalizados, na STFT. Os limiares percentuais considerados na limiarização estão no intervalo de 5% a 95%. Assim, as regiões isoladas com magnitudes maiores que zero são consideradas possíveis aproximações das localizações das CDSs.

Utilizamos medidas de acurácia para avaliar o desempenho dos métodos em termos de sensibilidade (Sn, Eq. 4.18), especificidade (Sp, Eq. 4.19) e coeficientes de correlação (CC, Eq. 4.20) nas identificações realizadas para um dado limiar. Estas medidas indicam a qualidade nas identificações de forma objetiva. Portanto algumas delas podem não ser consistentes com percepções biológicas. Medidas subjetivas não foram consideradas na análise dos resultados deste trabalho.

Para toda a análise dos resultados, no caso dos organismos eucariotos, consideramos que em cada seqüência de DNA existe somente um gene, em que as primeiras e as últimas CDSs correspondem às regiões codificantes dos primeiros e dos últimos éxons, respectivamente. Já no caso dos procariotos, as regiões identificadas corresponderão aos possíveis genes, pois os genes destes organismos mantêm somente uma CDS.

No momento todos os procedimentos, dentro do método automático de identificação, foram implementados usando MATLAB $^{\textrm{\scriptsize\textregistered }}$, estando disponíveis como um toolbox no endereço http://www.vision.ime.usp.br/~jmena/DSPgenomics/.


6.1 Testes em Seqüências Sintéticas de DNA

Foram utilizadas as seqüências sintéticas sintética1_0 e sintética2_0 descritas no Apêndice A.1 para avaliar a identificação de regiões onde a periodicidade é uniforme.

Figura 6.1: Desempenho da MMT e da STFT para a seqüência sintética1_0.
[Coeficientes MMT normalizados]\includegraphics[width=.4\textwidth]{S1_escalograma} [Coeficientes da projeção da MMT]\includegraphics[width=.405\textwidth]{S1_projecao}
[Coeficientes STFT com janela de 200bp]\includegraphics[width=.4\textwidth]{S1_200} [Coeficientes STFT com janela de 400bp]\includegraphics[width=.405\textwidth]{S1_400}
[Desempenho em termos de Sn e Sp]\includegraphics[width=.4\textwidth]{S1_snsp} [Desempenho em termos de CC e limiar]\includegraphics[width=.405\textwidth]{S1_cc}

Figura 6.2: Desempenho da MMT e da STFT para a seqüência sintética2_0.
[Coeficientes MMT normalizados]\includegraphics[width=.4\textwidth]{S2_escalograma} [Coeficientes da projeção da MMT]\includegraphics[width=.405\textwidth]{S2_projecao}
[Coeficientes STFT com janela de 200bp]\includegraphics[width=.4\textwidth]{S2_200} [Coeficientes STFT com janela de 400bp]\includegraphics[width=.405\textwidth]{S2_400}
[Desempenho em termos de Sn e Sp]\includegraphics[width=.4\textwidth]{S2_snsp} [Desempenho em termos de CC e limiar]\includegraphics[width=.405\textwidth]{S2_cc}


6.2 Testes em Seqüências Reais de DNA

Utilizamos oito seqüências reais de DNA para avaliar a identificação de CDSs onde a TBP seja latente. Todos as seqüências, com exceção do gene F56F11.4, pertencem ao conjunto de seqüências A (Apêndice A.2).


Figura 6.3: Desempenho da MMT e da STFT para o gene BTU02285.
[Coeficientes MMT normalizados]\includegraphics[width=.4\textwidth]{BT_escalograma} [Coeficientes da projeção da MMT]\includegraphics[width=.405\textwidth]{BT_projecao}
[Coeficientes STFT com janela de 200bp]\includegraphics[width=.4\textwidth]{BT_200} [Coeficientes STFT com janela de 400bp]\includegraphics[width=.405\textwidth]{BT_400}
[Desempenho em termos de Sn e Sp]\includegraphics[width=.4\textwidth]{BT_snsp} [Desempenho em termos de CC e limiar]\includegraphics[width=.405\textwidth]{BT_cc}

Figura 6.4: Desempenho da MMT e da STFT para o gene F56F11.4.
[Coeficientes MMT normalizados]\includegraphics[width=.4\textwidth]{F5_escalograma} [Coeficientes da projeção da MMT]\includegraphics[width=.405\textwidth]{F5_projecao}
[Coeficientes STFT com janela de 200bp]\includegraphics[width=.4\textwidth]{F5_200} [Coeficientes STFT com janela de 400bp]\includegraphics[width=.405\textwidth]{F5_400}
[Desempenho em termos de Sn e Sp]\includegraphics[width=.4\textwidth]{F5_snsp} [Desempenho em termos de CC e limiar]\includegraphics[width=.405\textwidth]{F5_cc}

Figura 6.5: Desempenho da MMT e da STFT para o gene GGVITIIG.
[Coeficientes MMT normalizados]\includegraphics[width=.4\textwidth]{GG_escalograma} [Coeficientes da projeção da MMT]\includegraphics[width=.405\textwidth]{GG_projecao}
[Coeficientes STFT com janela de 200bp]\includegraphics[width=.4\textwidth]{GG_200} [Coeficientes STFT com janela de 400bp]\includegraphics[width=.405\textwidth]{GG_400}
[Desempenho em termos de Sn e Sp]\includegraphics[width=.4\textwidth]{GG_snsp} [Desempenho em termos de CC e limiar]\includegraphics[width=.405\textwidth]{GG_cc}

Figura 6.6: Desempenho da MMT e da STFT para o gene HSDAO.
[Coeficientes MMT normalizados]\includegraphics[width=.4\textwidth]{HS_escalograma} [Coeficientes da projeção da MMT]\includegraphics[width=.405\textwidth]{HS_projecao}
[Coeficientes STFT com janela de 200bp]\includegraphics[width=.4\textwidth]{HS_200} [Coeficientes STFT com janela de 400bp]\includegraphics[width=.405\textwidth]{HS_400}
[Desempenho em termos de Sn e Sp]\includegraphics[width=.4\textwidth]{HS_snsp} [Desempenho em termos de CC e limiar]\includegraphics[width=.405\textwidth]{HS_cc}

Figura 6.7: Desempenho da MMT e da STFT para o gene HUMCS3.
[Coeficientes MMT normalizados]\includegraphics[width=.4\textwidth]{HU_escalograma} [Coeficientes da projeção da MMT]\includegraphics[width=.405\textwidth]{HU_projecao}
[Coeficientes STFT com janela de 200bp]\includegraphics[width=.4\textwidth]{HU_200} [Coeficientes STFT com janela de 400bp]\includegraphics[width=.405\textwidth]{HU_400}
[Desempenho em termos de Sn e Sp]\includegraphics[width=.4\textwidth]{HU_snsp} [Desempenho em termos de CC e limiar]\includegraphics[width=.405\textwidth]{HU_cc}

Figura 6.8: Desempenho da MMT e da STFT para o gene MMACLGNA.
[Coeficientes MMT normalizados]\includegraphics[width=.4\textwidth]{MM_escalograma} [Coeficientes da projeção da MMT]\includegraphics[width=.405\textwidth]{MM_projecao}
[Coeficientes STFT com janela de 200bp]\includegraphics[width=.4\textwidth]{MM_200} [Coeficientes STFT com janela de 400bp]\includegraphics[width=.405\textwidth]{MM_400}
[Desempenho em termos de Sn e Sp]\includegraphics[width=.4\textwidth]{MM_snsp} [Desempenho em termos de CC e limiar]\includegraphics[width=.405\textwidth]{MM_cc}


6.3 Testes em Conjuntos de Seqüências de DNA

Para seis conjuntos de seqüências de DNA (Apêndice A.2) estimamos as medidas de acurácia (Tabela C.9 a C.14). Mostramos, nas Figuras 6.9 e 6.10, as medidas de desempenho da MMT e da STFT em termos de Sn e Sp, e de CC e limiar para todos os conjuntos tratados.

Para os conjuntos de seqüências A e B, a utilização da MMT, no método, apresenta desempenho superior à STFT com comprimentos de janela de 200bp e 400bp. Para o conjunto A, obteve-se uma acurácia máxima de 0.47, com um limiar de 80%. Por outro lado, para o conjunto B, obteve-se uma acurácia máxima de 0.42, com um limiar de 80%. Níveis de acurácia similares foram obtidos para os conjuntos Am30, e Bm30.

Vale salientar que o método proposto para a identificação de CDSs, através da MMT, apresenta melhor desempenho em seqüências de DNA que possuam CDSs cujos comprimentos sejam maiores que 100bp. Para o conjunto Am100, obteve-se uma acurácia máxima de 0.55, com um limiar de 75%. Por outro lado, para o conjunto Bm100, obteve-se uma acurácia máxima de 0.51, com um limiar de 70%

Finalmente, mostramos os histogramas dos comprimentos dos éxons e dos íntrons para os conjuntos através da MMT (Figs. 6.11 e 6.12) em que obtiveram-se os melhores níveis de acurácia. Notemos que as distribuições nas freqüências dos comprimentos dos éxons e íntrons mantém a mesma forma que as distribuições calculadas para as seqüências reais (Figs. A.1 e A.2). Essa forma nas distribuições é um bom sinal do desempenho do método desenvolvido. Acreditamos que uma análise mais aprofundada do método deve seguir essa abordagem.

Figura 6.9: Desempenho da MMT e da STFT em termos de Sn e Sp (esquerda), e de CC e limiar (direita) para os conjuntos A, Am30 e Am100.
\includegraphics[width=.4\textwidth]{setA_snsp} \includegraphics[width=.405\textwidth]{setA_cc}
(a) Conjunto A
\includegraphics[width=.4\textwidth]{setAm30_snsp} \includegraphics[width=.405\textwidth]{setAm30_cc}
(b) Conjunto Am30
\includegraphics[width=.4\textwidth]{setAm100_snsp} \includegraphics[width=.405\textwidth]{setAm100_cc}
(c) Conjunto Am100

Figura 6.10: Desempenho da MMT e da STFT em termos de Sn e Sp (esquerda), e de CC e limiar (direita) para os conjuntos B, Bm30 e Bm100.
\includegraphics[width=.4\textwidth]{setB_snsp} \includegraphics[width=.405\textwidth]{setB_cc}
(a) Conjunto B
\includegraphics[width=.4\textwidth]{setBm30_snsp} \includegraphics[width=.405\textwidth]{setBm30_cc}
(b) Conjunto Bm30
\includegraphics[width=.4\textwidth]{setBm100_snsp} \includegraphics[width=.405\textwidth]{setBm100_cc}
(c) Conjunto Bm100

Figura 6.11: Histogramas dos comprimentos dos éxons (esquerda), e dos íntrons (direita) para os conjuntos A, Am30 e Am100 identificados através da MMT.
\includegraphics[width=.4\textwidth]{setA_cds_mmt} \includegraphics[width=.4\textwidth]{setA_int_mmt}
(a) Conjunto A, identificado com limiar de 75%
\includegraphics[width=.4\textwidth]{setAm30_cds_mmt} \includegraphics[width=.4\textwidth]{setAm30_int_mmt}
(b) Conjunto Am30, identificado com limiar de 80%
\includegraphics[width=.4\textwidth]{setAm100_cds_mmt} \includegraphics[width=.4\textwidth]{setAm100_int_mmt}
(c) Conjunto Am100, identificado com limiar de 75%

Figura 6.12: Histogramas dos comprimentos dos éxons (esquerda), e dos íntrons (direita) para os conjuntos B, Bm30 e Bm100 identificados através da MMT.
\includegraphics[width=.4\textwidth]{setB_cds_mmt} \includegraphics[width=.4\textwidth]{setB_int_mmt}
(a) Conjunto B, identificado com limiar de 70%
\includegraphics[width=.4\textwidth]{setBm30_cds_mmt} \includegraphics[width=.4\textwidth]{setBm30_int_mmt}
(b) Conjunto Bm30, identificado com limiar de 70%
\includegraphics[width=.4\textwidth]{setBm100_cds_mmt} \includegraphics[width=.4\textwidth]{setBm100_int_mmt}
(c) Conjunto Bm100, identificado com limiar de 70%


7. Conclusões

7.1 Considerações Finais

Atualmente a identificação de genes é um problema complexo, e a identificação de regiões com TBP é unicamente mais um passo na frente para a identificação de CDSs [57]. Assim, neste estudo, um novo método foi introduzido para a identificação computacional de CDSs, de organismos procariotos ou eucariotos, em que a TBP seja latente. Este método, que emprega uma nova transformada, ou seja, a MMT, pode ajudar aos especialistas anotadores de genoma, fornecendo uma estrutura geral para encontrar regiões codificantes em uma dada seqüência de DNA desconhecida.

A principal vantagem do método proposto é a de basear-se unicamente na TBP existente, geralmente, nas CDSs. Não é usada nenhuma outra informação adicional, como conjuntos de treinamento ou seqüências homólogas de outras espécies cujas seqüências e genes já sejam conhecidas [4]. Nesse sentido, o método em parte é flexível, aceitando seqüências de DNA que não sejam bem caracterizadas [39]7.1. Acredita-se que, com o uso dessa informação, pode-se obter um identificador com um nível de acurácia maior. Também é importante observar que este novo método é mais robusto à variação de escala. Tal dependência é um dos maiores problemas dos outros métodos similares propostos até hoje.

Mediante experimentos comparativos dos métodos de identificação de CDSs podemos concluir que a MMT tem um desempenho superior à STFT. Em ambos métodos obtiveram-se melhor acurácia quando o valor de limiarização é próximo de 85%. Isso indica que aproximadamente o 15% dos coeficientes de projeção serão indicadores de TBP. Esta porcentagem está diretamente relacionada com as estatísticas extraídas dos conjuntos de seqüências de organismos eucariotos utilizadas nas experimentações (Veja o apêndice A.2). Deverá ser considerado um valor de limiarização menor para análise de seqüências de organismos procariotos (e.g. 40%, correspondente à porcentagem das bases não pertencentes às CDSs nos organismos procariotos [27]). Finalmente, um nível de acurácia maior é alcançado quando os comprimentos das CDSs, nas seqüências de DNA analisadas, são maiores que 100bp.

7.2 Sugestões para Pesquisas Futuras

Na análise de seqüências de DNA e, em particular, a identificação de CDSs, muitas questões estão em aberto [16,61]. Apesar do grande progresso da identificação de genes e do reconhecimento de padrões baseados na análise de DNA, ainda estamos em uma etapa inicial da bioinformática [48]. A seguir, descrevemos algumas questões importantes, na nossa pesquisa, às quais por enquanto não podemos responder. Estas questões precisam ser pesquisadas a futuro.


A. Seqüências de DNA Testadas no Trabalho


A.1 Seqüências Sintéticas

Descrevemos as composições das regiões periódicas das seqüências sintéticas usadas nos experimentos apresentados neste trabalho. As posições não indicadas nessas seqüências correspondem às regiões aleatórias com probabilidade de atribuição de 25% para cada uma das bases. Todas as seqüências criadas sinteticamente estão disponíveis no endereço http://www.vision.ime.usp.br/~jmena/DSPgenomics/.


Tabela A.1: Posições das regiões periódicas na seqüência sintética1_0.
Posições Comprimento Periodicidade Seqüência periódica
301 - 800 500 2 AT
1401 - 1520 120 3 CGT
1571 - 1770 200 4 TGCA
2571 - 2970 400 5 ACTNN
3371 - 4170 800 6 TGCNNN
5171 - 5870 700 3 TCA



Tabela A.2: Posições das regiões periódicas da seqüência sintética2_0.
Posições Comprimento Periodicidade Seqüência periódica
501 - 900 400 3 ATC
1501 - 1620 120 3 TAC
1721 - 1870 150 3 CAG
3791 - 3820 30 3 CAG
4421 - 4670 250 3 GAT
5071 - 7070 2000 3 ACG
8231 - 8310 80 3 TCG
9111 - 9460 350 3 ACT
9661 - 9760 100 3 GAC



A.2 Seqüências Reais

As seqüências reais utilizadas são as pertencentes a organismos eucariotos cujos limites éxon-íntron foram anotados, com base nas interpretações de evidências biológicas.

Para a análise e avaliação do desempenho do método desenvolvido neste trabalho, criamos sub-conjuntos correspondentes às seqüências com comprimentos mínimos, nos éxons, de 30bp e 100bp. Assim, para o conjunto A, criamos dois sub-conjuntos denominados setAm30 e setAm100 correspondentes aos comprimentos mínimos de 30bp e 100bp nos éxons. Analogamente, para o conjunto B, criamos dois sub-conjuntos denominados setBm30 e setBm100 correspondentes aos comprimentos mínimos de 30bp e 100bp nos éxons.

Algumas estatísticas extraídas desses conjuntos de seqüências são mostradas nas Tabelas A.3 a A.8. Apresentamos a quantidade de regiões, número de bases nas regiões, e a média e desvio padrão para cada tipo de região nas seqüências de DNA. Nas Figuras A.1 e A.2 são mostradas os histogramas dos comprimentos dos éxons e dos íntrons para todos os conjuntos de seqüências reais aqui tratados.


Tabela A.3: Estatísticas extraídas do conjunto A (570 seqüências).
Região Quantidade Bases Comprimento Conteúdo
Média Desvio A C G T N
Éxon 2649 444498 (15.4%) 168 222 108013 120970 124055 91459 1
Íntron 2079 1310452 (45.3%) 630 909 332478 298396 310586 368597 395
Inter-gênica 1132 1137199 (39.3%) 1004 1464 296109 270067 267702 302844 477
Total 5860 2892149 - - 736600 689433 702343 762900 873



Tabela A.4: Estatísticas extraídas do conjunto Am30 (469 seqüências).
Região Quantidade Bases Comprimento Conteúdo
Média Desvio A C G T N
Éxon 1993 355968 (15.4%) 178 240 86200 96924 99335 73508 1
Íntron 1524 999122 (43.3%) 655 927 256824 225685 234286 281956 371
Inter-gênica 930 951584 (41.3%) 1023 1552 249184 224757 223252 253961 430
Total 4447 2306674 - - 592208 547366 556873 609425 802



Tabela A.5: Estatísticas extraídas do conjunto Am100 (103 seqüências).
Região Quantidade Bases Comprimento Conteúdo
Média Desvio A C G T N
Éxon 367 114219 (22.1%) 311 477 27027 32426 33492 21274 0
Íntron 264 182947 (35.3%) 693 824 45305 44493 44229 48890 30
Inter-gênica 206 220991 (42.6%) 1072 1193 55229 53386 55502 56867 7
Total 837 518157 - - 127561 130305 133223 127031 37



Tabela A.6: Estatísticas extraídas do conjunto B (195 seqüências).
Região Quantidade Bases Comprimento Conteúdo
Média Desvio A C G T N
Éxon 948 199176 (14.4%) 210 271 45313 56391 54972 42497 3
Íntron 753 642788 (46.4%) 854 130 160740 148259 156493 177184 112
Inter-gênica 390 544044 (39.2%) 1395 2261 137851 130025 131901 144012 255
Total 2091 1386008 - - 343904 334675 343366 363693 370



Tabela A.7: Estatísticas extraídas do conjunto Bm30 (166 seqüências).
Região Quantidade Bases Comprimento Conteúdo
Média Desvio A C G T N
Éxon 745 168126 (13.9%) 226 275 38194 47758 46288 35884 2
Íntron 579 550301 (45.8%) 950 1403 139721 125292 132271 152913 104
Inter-gênica 332 484087 (40.3%) 1458 2397 123649 115034 116326 128977 101
Total 1656 1202514 - - 301564 288084 294885 317774 207



Tabela A.8: Estatísticas extraídas do conjunto Bm100 (83 seqüências).
Região Quantidade Bases Comprimento Conteúdo
Média Desvio A C G T N
Éxon 185 88971 (18.5%) 481 429 20331 25394 23938 19306 2
Íntron 102 123658 (25.8%) 1212 1122 33775 27053 28138 34666 26
Inter-gênica 166 267236 (55.7%) 1609 3001 70259 61416 62699 72786 76
Total 453 479865 - - 124365 113863 114775 126758 104


Figura A.1: Histogramas dos comprimentos dos éxons (esquerda), e dos íntrons (direita) para os conjuntos A, Am30 e Am100.
\includegraphics[width=.4\textwidth]{setA_cds} \includegraphics[width=.4\textwidth]{setA_int}
(a) Conjunto A
\includegraphics[width=.4\textwidth]{setAm30_cds} \includegraphics[width=.40\textwidth]{setAm30_int}
(b) Conjunto Am30
\includegraphics[width=.4\textwidth]{setAm100_cds} \includegraphics[width=.40\textwidth]{setAm100_int}
(c) Conjunto Am100

Figura A.2: Histogramas dos comprimentos dos éxons (esquerda), e dos íntrons (direita) para os conjuntos B, Bm30 e Bm100.
\includegraphics[width=.4\textwidth]{setB_cds} \includegraphics[width=.4\textwidth]{setB_int}
(a) Conjunto B
\includegraphics[width=.4\textwidth]{setBm30_cds} \includegraphics[width=.40\textwidth]{setBm30_int}
(b) Conjunto Bm30
\includegraphics[width=.4\textwidth]{setBm100_cds} \includegraphics[width=.40\textwidth]{setBm100_int}
(c) Conjunto Bm100


B. Periodicidades em Seqüências Sintéticas com Ruído

As estimativas de periodicidade das seqüências sintéticas sintética2_XA e sintética2_XB (Apêndice A.1) são representadas nas Figuras B.1 e B.2.

Observemos que a magnitude da periodicidade três nas regiões periódicas (que simulam TBP existente nas CDSs) é claramente maior que as magnitudes das não periódicas (íntron e inter-gênica) e, na medida que a porcentagem do ruído aumenta, as magnitudes das periodicidades vão tornando-se indistintas para essas regiões. Entretanto, para a seqüência sintética2_100B, que tem ruído em 100% das bases pertencentes a suas regiões periódicas, existe uma magnitude maior para a periodicidade três em comparação às demais regiões, pois o ruído inserido é privativo. Veja na Figura 4.4(b) um comportamento similar no cálculo dos espectros de freqüência.

Figura B.1: Periodicidades estimadas para seqüências sintéticas com ruído. Foram calculadas as periodicidades 2 a 24 das regiões periódicas (que simulam TBP) e regiões não-periódicas (regiões que simulam às regiões inter-gênicas e, no caso dos organismos eucariotos, íntrons).
[sintética2_20A]\includegraphics[width=.4\textwidth]{sintetica2_20A} [sintética2_20B]\includegraphics[width=.4\textwidth]{sintetica2_20B}
[sintética2_40A]\includegraphics[width=.4\textwidth]{sintetica2_40A} [sintética2_40B]\includegraphics[width=.4\textwidth]{sintetica2_40B}
[sintética2_60A]\includegraphics[width=.4\textwidth]{sintetica2_60A} [sintética2_60B]\includegraphics[width=.4\textwidth]{sintetica2_60B}

Figura B.2: Periodicidades estimadas para as seqüências sintéticas com ruído. Foram calculadas as periodicidades 2 a 24 das regiões periódicas (que simulam TBP) e regiões não-periódicas (regiões que simulam às regiões inter-gênicas e, no caso dos organismos eucariotos, íntrons). (continuação)
[sintética2_80A]\includegraphics[width=.4\textwidth]{sintetica2_80A} [sintética2_80B]\includegraphics[width=.4\textwidth]{sintetica2_80B}
[sintética2_100A]\includegraphics[width=.4\textwidth]{sintetica2_100A} [sintética2_100B]\includegraphics[width=.4\textwidth]{sintetica2_100B}


C. Tabelas de Acurácia estimadas para Seqüências de DNA

Apresentamos medidas de acurácia (Seção 4.6) estimadas para seqüências de DNA (Apêndice A). Foram utilizadas a MMT com 40 escalas exponencialmente espaçadas no intervalo 0.05 a 0.5, e a STFT com cumprimentos de janela de 200bp e 400bp, para a identificação (1) das regiões com periodicidade três, nas seqüências sintéticas; e (2) das regiões com TBP, nas seqüências reais.


Tabela C.1: Medidas de acurácia estimadas para a seqüência sintética1_0.
Limiar MMT STFT (200) STFT (400)
Sn Sp CC Sn Sp CC Sn Sp CC
05% 1.00 0.14 0.09 1.00 0.14 0.09 1.00 0.14 0.09
10% 1.00 0.15 0.13 1.00 0.15 0.13 1.00 0.15 0.13
15% 1.00 0.16 0.17 1.00 0.16 0.17 1.00 0.16 0.17
20% 1.00 0.17 0.20 1.00 0.17 0.20 1.00 0.17 0.20
25% 1.00 0.18 0.23 1.00 0.18 0.23 1.00 0.18 0.23
30% 1.00 0.20 0.26 1.00 0.20 0.26 1.00 0.20 0.26
35% 1.00 0.21 0.29 1.00 0.21 0.29 1.00 0.21 0.29
40% 1.00 0.23 0.32 1.00 0.23 0.32 1.00 0.23 0.32
45% 1.00 0.25 0.36 1.00 0.25 0.36 1.00 0.25 0.36
50% 1.00 0.27 0.40 1.00 0.27 0.40 1.00 0.27 0.40
55% 1.00 0.30 0.44 1.00 0.30 0.44 1.00 0.30 0.44
60% 1.00 0.34 0.49 1.00 0.34 0.49 1.00 0.34 0.49
65% 1.00 0.39 0.54 1.00 0.39 0.54 1.00 0.39 0.54
70% 1.00 0.46 0.61 1.00 0.46 0.61 0.97 0.44 0.58
75% 1.00 0.55 0.69 1.00 0.55 0.69 0.85 0.47 0.55
80% 0.96 0.66 0.76 1.00 0.68 0.80 0.85 0.58 0.65
85% 0.93 0.85 0.87 1.00 0.91 0.95 0.85 0.78 0.78
90% 0.73 1.00 0.84 0.73 1.00 0.84 0.73 1.00 0.84
95% 0.36 1.00 0.58 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00



Tabela C.2: Medidas de acurácia estimadas para a seqüência sintética2_0.
Limiar MMT STFT (200) STFT (400)
Sn Sp CC Sn Sp CC Sn Sp CC
05% 1.00 0.37 0.17 1.00 0.37 0.17 1.00 0.37 0.17
10% 1.00 0.39 0.24 1.00 0.39 0.24 1.00 0.39 0.24
15% 1.00 0.41 0.31 1.00 0.41 0.31 1.00 0.41 0.31
20% 1.00 0.44 0.37 1.00 0.44 0.37 1.00 0.44 0.37
25% 1.00 0.46 0.42 1.00 0.46 0.42 1.00 0.46 0.42
30% 1.00 0.50 0.48 1.00 0.50 0.48 1.00 0.50 0.48
35% 1.00 0.54 0.54 1.00 0.54 0.54 1.00 0.53 0.53
40% 1.00 0.58 0.60 1.00 0.58 0.60 0.99 0.58 0.58
45% 1.00 0.63 0.66 1.00 0.63 0.66 0.99 0.63 0.65
50% 1.00 0.70 0.73 1.00 0.70 0.73 0.97 0.68 0.69
55% 0.99 0.77 0.80 1.00 0.77 0.80 0.97 0.75 0.76
60% 0.99 0.86 0.88 0.99 0.86 0.88 0.92 0.80 0.77
65% 0.97 0.96 0.94 0.96 0.96 0.94 0.89 0.89 0.83
70% 0.86 1.00 0.90 0.86 1.00 0.90 0.85 0.98 0.87
75% 0.72 1.00 0.79 0.72 1.00 0.79 0.72 1.00 0.79
80% 0.57 1.00 0.68 0.00 1.00 0.02 0.57 1.00 0.68
85% 0.43 1.00 0.57 0.00 1.00 0.02 0.00 0.00 0.00
90% 0.29 1.00 0.46 0.00 1.00 0.02 0.00 0.00 0.00
95% 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 0.02 0.00 0.00 0.00



Tabela C.3: Medidas de acurácia estimadas para o gene BTU02285.
Limiar MMT STFT (200) STFT (400)
Sn Sp CC Sn Sp CC Sn Sp CC
05% 1.00 0.19 0.11 1.00 0.19 0.11 1.00 0.19 0.11
10% 1.00 0.20 0.15 1.00 0.20 0.15 1.00 0.20 0.15
15% 1.00 0.21 0.20 1.00 0.21 0.20 1.00 0.21 0.20
20% 1.00 0.22 0.23 1.00 0.22 0.23 1.00 0.22 0.23
25% 1.00 0.24 0.27 1.00 0.24 0.27 0.99 0.23 0.26
30% 1.00 0.25 0.30 1.00 0.25 0.30 0.98 0.25 0.29
35% 0.99 0.27 0.33 1.00 0.27 0.34 0.95 0.26 0.29
40% 0.99 0.29 0.37 1.00 0.29 0.37 0.92 0.27 0.30
45% 0.99 0.32 0.41 0.99 0.32 0.41 0.90 0.29 0.33
50% 0.99 0.35 0.45 0.99 0.35 0.45 0.89 0.32 0.37
55% 0.98 0.39 0.50 0.98 0.39 0.50 0.88 0.35 0.40
60% 0.98 0.43 0.55 0.98 0.43 0.55 0.86 0.38 0.44
65% 0.98 0.49 0.61 0.97 0.49 0.60 0.83 0.42 0.47
70% 0.97 0.57 0.67 0.94 0.56 0.65 0.81 0.48 0.51
75% 0.95 0.67 0.75 0.90 0.64 0.69 0.77 0.55 0.56
80% 0.93 0.82 0.84 0.83 0.74 0.73 0.73 0.65 0.61
85% 0.81 0.96 0.86 0.76 0.89 0.79 0.58 0.69 0.56
90% 0.56 1.00 0.72 0.56 1.00 0.72 0.44 0.78 0.53
95% 0.28 1.00 0.49 0.28 1.00 0.49 0.20 0.71 0.32



Tabela C.4: Medidas de acurácia estimadas para o gene F56F11.4.
Limiar MMT STFT (200) STFT (400)
Sn Sp CC Sn Sp CC Sn Sp CC
05% 1.00 0.16 0.10 1.00 0.16 0.10 1.00 0.16 0.10
10% 1.00 0.17 0.14 1.00 0.17 0.14 1.00 0.17 0.14
15% 1.00 0.18 0.18 1.00 0.18 0.18 1.00 0.18 0.18
20% 1.00 0.19 0.21 1.00 0.19 0.21 1.00 0.19 0.21
25% 1.00 0.21 0.25 1.00 0.21 0.25 1.00 0.21 0.25
30% 1.00 0.22 0.28 1.00 0.22 0.28 1.00 0.22 0.28
35% 1.00 0.24 0.31 1.00 0.24 0.31 1.00 0.24 0.31
40% 1.00 0.26 0.35 1.00 0.26 0.35 1.00 0.26 0.35
45% 1.00 0.28 0.38 0.99 0.28 0.38 1.00 0.28 0.39
50% 0.99 0.31 0.42 0.98 0.30 0.41 0.98 0.30 0.41
55% 0.99 0.34 0.47 0.96 0.33 0.44 0.96 0.33 0.44
60% 0.99 0.38 0.51 0.94 0.36 0.47 0.93 0.36 0.47
65% 0.98 0.43 0.57 0.91 0.40 0.51 0.91 0.40 0.50
70% 0.97 0.50 0.63 0.89 0.46 0.55 0.88 0.45 0.54
75% 0.96 0.60 0.71 0.86 0.53 0.60 0.85 0.53 0.59
80% 0.95 0.74 0.80 0.81 0.63 0.65 0.80 0.62 0.64
85% 0.87 0.90 0.86 0.71 0.73 0.67 0.71 0.73 0.67
90% 0.59 0.92 0.71 0.54 0.84 0.63 0.55 0.85 0.64
95% 0.32 1.00 0.54 0.28 0.88 0.46 0.31 0.96 0.51



Tabela C.5: Medidas de acurácia estimadas para o gene GGVITIIG.
Limiar MMT STFT (200) STFT (400)
Sn Sp CC Sn Sp CC Sn Sp CC
05% 0.98 0.28 0.08 0.98 0.28 0.09 0.98 0.28 0.07
10% 0.97 0.29 0.14 0.96 0.29 0.11 0.93 0.28 0.06
15% 0.94 0.30 0.16 0.93 0.30 0.13 0.89 0.28 0.06
20% 0.91 0.31 0.17 0.90 0.31 0.15 0.85 0.29 0.07
25% 0.88 0.32 0.18 0.87 0.32 0.17 0.81 0.29 0.08
30% 0.85 0.33 0.20 0.82 0.32 0.17 0.76 0.30 0.08
35% 0.82 0.34 0.21 0.78 0.33 0.17 0.73 0.31 0.10
40% 0.78 0.36 0.23 0.74 0.34 0.18 0.69 0.31 0.11
45% 0.74 0.37 0.23 0.70 0.35 0.18 0.66 0.33 0.13
50% 0.71 0.39 0.25 0.65 0.35 0.18 0.62 0.34 0.15
55% 0.66 0.40 0.26 0.60 0.37 0.19 0.58 0.35 0.16
60% 0.61 0.41 0.26 0.55 0.38 0.19 0.54 0.37 0.18
65% 0.56 0.44 0.28 0.51 0.40 0.20 0.50 0.39 0.19
70% 0.52 0.47 0.30 0.45 0.41 0.21 0.44 0.40 0.19
75% 0.45 0.49 0.29 0.40 0.44 0.22 0.39 0.42 0.20
80% 0.40 0.55 0.31 0.34 0.47 0.22 0.33 0.45 0.20
85% 0.34 0.61 0.32 0.28 0.52 0.23 0.27 0.49 0.21
90% 0.26 0.70 0.32 0.22 0.61 0.25 0.21 0.58 0.23
95% 0.15 0.84 0.29 0.15 0.80 0.27 0.15 0.84 0.29



Tabela C.6: Medidas de acurácia estimadas para o gene HSDAO.
Limiar MMT STFT (200) STFT (400)
Sn Sp CC Sn Sp CC Sn Sp CC
05% 1.00 0.24 0.12 1.00 0.24 0.12 1.00 0.24 0.12
10% 1.00 0.25 0.18 1.00 0.25 0.17 1.00 0.25 0.18
15% 1.00 0.27 0.23 0.99 0.27 0.21 1.00 0.27 0.23
20% 1.00 0.28 0.27 0.99 0.28 0.26 1.00 0.28 0.27
25% 1.00 0.30 0.31 0.99 0.30 0.30 1.00 0.30 0.31
30% 1.00 0.33 0.36 0.98 0.32 0.34 1.00 0.32 0.35
35% 1.00 0.35 0.40 0.98 0.34 0.38 0.99 0.35 0.39
40% 1.00 0.38 0.44 0.98 0.37 0.42 0.99 0.38 0.43
45% 1.00 0.41 0.49 0.97 0.40 0.46 0.99 0.41 0.48
50% 0.99 0.45 0.54 0.96 0.44 0.50 0.98 0.45 0.53
55% 0.99 0.50 0.59 0.94 0.47 0.53 0.98 0.50 0.58
60% 0.98 0.56 0.64 0.91 0.52 0.57 0.98 0.56 0.64
65% 0.97 0.63 0.71 0.88 0.57 0.60 0.96 0.62 0.69
70% 0.94 0.72 0.76 0.83 0.63 0.63 0.92 0.70 0.74
75% 0.91 0.83 0.83 0.76 0.70 0.64 0.87 0.79 0.77
80% 0.83 0.95 0.86 0.66 0.75 0.63 0.80 0.91 0.81
85% 0.65 0.98 0.76 0.54 0.81 0.59 0.63 0.96 0.73
90% 0.44 1.00 0.61 0.40 0.92 0.55 0.44 1.00 0.61
95% 0.22 1.00 0.42 0.22 1.00 0.42 0.22 1.00 0.42



Tabela C.7: Medidas de acurácia estimadas para o gene HUMCS3.
Limiar MMT STFT (200) STFT (400)
Sn Sp CC Sn Sp CC Sn Sp CC
05% 1.00 0.25 0.13 1.00 0.25 0.13 0.99 0.25 0.09
10% 1.00 0.26 0.19 1.00 0.26 0.19 0.96 0.25 0.12
15% 1.00 0.28 0.23 1.00 0.28 0.23 0.94 0.26 0.14
20% 0.95 0.28 0.21 0.99 0.29 0.27 0.93 0.28 0.18
25% 0.93 0.30 0.24 0.99 0.31 0.31 0.92 0.29 0.21
30% 0.92 0.31 0.26 0.98 0.33 0.35 0.90 0.31 0.25
35% 0.90 0.33 0.29 0.98 0.36 0.39 0.89 0.33 0.28
40% 0.89 0.35 0.33 0.97 0.38 0.42 0.86 0.34 0.30
45% 0.88 0.38 0.38 0.95 0.41 0.45 0.81 0.35 0.29
50% 0.88 0.42 0.42 0.91 0.43 0.46 0.79 0.38 0.33
55% 0.87 0.46 0.47 0.87 0.46 0.47 0.78 0.41 0.37
60% 0.84 0.50 0.51 0.82 0.49 0.48 0.77 0.46 0.42
65% 0.79 0.54 0.52 0.75 0.51 0.47 0.74 0.50 0.45
70% 0.71 0.56 0.50 0.68 0.54 0.46 0.71 0.56 0.50
75% 0.67 0.64 0.54 0.60 0.57 0.45 0.68 0.65 0.55
80% 0.63 0.75 0.61 0.52 0.62 0.45 0.60 0.72 0.56
85% 0.54 0.85 0.61 0.40 0.64 0.40 0.50 0.80 0.55
90% 0.39 0.93 0.54 0.34 0.81 0.45 0.33 0.79 0.44
95% 0.21 1.00 0.41 0.17 0.83 0.32 0.15 0.74 0.27



Tabela C.8: Medidas de acurácia estimadas para o gene MMACLGNA.
Limiar MMT STFT (200) STFT (400)
Sn Sp CC Sn Sp CC Sn Sp CC
05% 1.00 0.10 0.08 1.00 0.10 0.08 1.00 0.10 0.08
10% 1.00 0.11 0.11 1.00 0.11 0.11 1.00 0.11 0.11
15% 1.00 0.11 0.14 1.00 0.11 0.14 1.00 0.11 0.14
20% 1.00 0.12 0.16 1.00 0.12 0.16 1.00 0.12 0.16
25% 1.00 0.13 0.19 1.00 0.13 0.19 0.96 0.12 0.16
30% 1.00 0.14 0.21 1.00 0.14 0.21 0.90 0.12 0.14
35% 1.00 0.15 0.24 0.99 0.15 0.24 0.83 0.12 0.12
40% 1.00 0.16 0.27 0.99 0.16 0.26 0.77 0.12 0.11
45% 0.99 0.17 0.29 0.97 0.17 0.28 0.73 0.13 0.12
50% 0.96 0.19 0.30 0.95 0.18 0.30 0.71 0.14 0.14
55% 0.93 0.20 0.31 0.93 0.20 0.31 0.65 0.14 0.13
60% 0.89 0.22 0.33 0.87 0.21 0.32 0.59 0.14 0.13
65% 0.87 0.24 0.36 0.82 0.23 0.32 0.49 0.14 0.10
70% 0.85 0.27 0.39 0.77 0.25 0.33 0.42 0.13 0.08
75% 0.83 0.32 0.44 0.69 0.27 0.33 0.30 0.12 0.04
80% 0.78 0.38 0.48 0.58 0.28 0.31 0.17 0.08 -0.03
85% 0.55 0.36 0.37 0.44 0.29 0.27 0.06 0.04 -0.08
90% 0.25 0.24 0.16 0.31 0.30 0.23 0.00 0.00 -0.11
95% 0.00 0.00 -0.08 0.13 0.25 0.12 0.00 0.00 -0.07



Tabela C.9: Medidas de acurácia estimadas para o conjunto A.
Limiar MMT STFT (200) STFT (400)
Sn Sp CC Sn Sp CC Sn Sp CC
05% 0.99 0.21 0.10 0.99 0.21 0.10 0.99 0.21 0.09
10% 0.99 0.23 0.15 0.98 0.22 0.14 0.97 0.22 0.13
15% 0.98 0.24 0.18 0.97 0.23 0.17 0.96 0.23 0.15
20% 0.97 0.25 0.21 0.95 0.24 0.19 0.94 0.24 0.18
25% 0.96 0.26 0.24 0.93 0.26 0.22 0.92 0.25 0.20
30% 0.94 0.28 0.27 0.92 0.27 0.24 0.89 0.26 0.22
35% 0.93 0.29 0.29 0.90 0.28 0.26 0.87 0.28 0.23
40% 0.91 0.31 0.31 0.87 0.30 0.28 0.84 0.29 0.25
45% 0.89 0.33 0.34 0.84 0.31 0.30 0.81 0.30 0.26
50% 0.86 0.35 0.36 0.82 0.33 0.31 0.78 0.32 0.28
55% 0.84 0.38 0.39 0.78 0.35 0.33 0.74 0.34 0.29
60% 0.81 0.41 0.41 0.75 0.38 0.35 0.70 0.35 0.30
65% 0.77 0.44 0.44 0.70 0.40 0.36 0.65 0.37 0.31
70% 0.73 0.48 0.46 0.65 0.43 0.37 0.60 0.40 0.32
75% 0.68 0.53 0.47 0.59 0.47 0.38 0.54 0.43 0.32
80% 0.61 0.58 0.47 0.52 0.50 0.38 0.47 0.46 0.32
85% 0.51 0.63 0.46 0.44 0.55 0.37 0.38 0.49 0.30
90% 0.39 0.69 0.43 0.33 0.60 0.35 0.28 0.52 0.28
95% 0.22 0.75 0.34 0.19 0.66 0.28 0.15 0.55 0.21



Tabela C.10: Medidas de acurácia estimadas para o conjunto Am30.
Limiar MMT STFT (200) STFT (400)
Sn Sp CC Sn Sp CC Sn Sp CC
05% 0.99 0.22 0.11 0.99 0.22 0.10 0.99 0.22 0.09
10% 0.99 0.23 0.15 0.98 0.23 0.14 0.97 0.23 0.13
15% 0.98 0.24 0.19 0.97 0.24 0.17 0.96 0.24 0.16
20% 0.97 0.25 0.22 0.95 0.25 0.20 0.94 0.25 0.18
25% 0.96 0.27 0.25 0.94 0.26 0.22 0.92 0.26 0.20
30% 0.95 0.28 0.28 0.92 0.27 0.24 0.89 0.27 0.22
35% 0.93 0.30 0.30 0.90 0.29 0.26 0.87 0.28 0.24
40% 0.91 0.32 0.32 0.87 0.30 0.28 0.84 0.29 0.25
45% 0.89 0.34 0.35 0.85 0.32 0.30 0.81 0.31 0.27
50% 0.87 0.36 0.37 0.82 0.34 0.32 0.78 0.33 0.29
55% 0.85 0.39 0.40 0.78 0.36 0.34 0.74 0.34 0.30
60% 0.81 0.42 0.43 0.75 0.39 0.35 0.70 0.36 0.31
65% 0.78 0.46 0.45 0.70 0.41 0.37 0.66 0.39 0.32
70% 0.74 0.50 0.47 0.65 0.44 0.38 0.60 0.41 0.33
75% 0.68 0.54 0.48 0.59 0.48 0.39 0.54 0.44 0.33
80% 0.61 0.59 0.49 0.52 0.52 0.39 0.48 0.47 0.33
85% 0.52 0.65 0.47 0.44 0.56 0.37 0.39 0.50 0.32
90% 0.39 0.70 0.43 0.33 0.61 0.35 0.29 0.54 0.29
95% 0.22 0.77 0.34 0.19 0.68 0.28 0.16 0.57 0.22



Tabela C.11: Medidas de acurácia estimadas para o conjunto Am100.
Limiar MMT STFT (200) STFT (400)
Sn Sp CC Sn Sp CC Sn Sp CC
05% 1.00 0.27 0.12 0.99 0.27 0.12 0.99 0.27 0.12
10% 0.99 0.28 0.18 0.99 0.28 0.17 0.98 0.28 0.17
15% 0.98 0.30 0.22 0.98 0.29 0.21 0.97 0.29 0.21
20% 0.98 0.31 0.26 0.97 0.31 0.24 0.96 0.31 0.24
25% 0.97 0.33 0.30 0.96 0.33 0.28 0.94 0.32 0.27
30% 0.96 0.35 0.33 0.94 0.34 0.31 0.93 0.34 0.29
35% 0.95 0.37 0.37 0.93 0.36 0.34 0.91 0.36 0.32
40% 0.94 0.40 0.40 0.91 0.38 0.36 0.88 0.38 0.34
45% 0.93 0.43 0.44 0.88 0.41 0.39 0.86 0.40 0.37
50% 0.91 0.46 0.47 0.86 0.43 0.41 0.83 0.42 0.39
55% 0.89 0.49 0.50 0.82 0.46 0.43 0.80 0.45 0.40
60% 0.85 0.53 0.52 0.78 0.48 0.44 0.76 0.47 0.41
65% 0.81 0.57 0.54 0.74 0.51 0.45 0.71 0.50 0.42
70% 0.76 0.61 0.55 0.68 0.55 0.45 0.66 0.53 0.42
75% 0.70 0.65 0.55 0.62 0.58 0.45 0.60 0.56 0.42
80% 0.62 0.70 0.54 0.54 0.62 0.44 0.52 0.60 0.42
85% 0.52 0.75 0.51 0.45 0.66 0.42 0.43 0.64 0.40
90% 0.40 0.81 0.47 0.34 0.72 0.39 0.32 0.69 0.36
95% 0.22 0.86 0.36 0.19 0.78 0.31 0.18 0.75 0.29



Tabela C.12: Medidas de acurácia estimadas para o conjunto B.
Limiar MMT STFT (200) STFT (400)
Sn Sp CC Sn Sp CC Sn Sp CC
05% 0.99 0.25 0.12 0.99 0.25 0.10 0.99 0.25 0.11
10% 0.98 0.26 0.16 0.97 0.26 0.14 0.98 0.26 0.16
15% 0.97 0.27 0.20 0.95 0.27 0.17 0.96 0.27 0.19
20% 0.96 0.29 0.23 0.93 0.28 0.19 0.94 0.28 0.21
25% 0.95 0.30 0.26 0.91 0.29 0.21 0.92 0.30 0.23
30% 0.93 0.32 0.28 0.89 0.30 0.23 0.90 0.31 0.25
35% 0.92 0.33 0.30 0.87 0.32 0.25 0.87 0.32 0.26
40% 0.90 0.35 0.32 0.84 0.33 0.27 0.84 0.33 0.28
45% 0.87 0.37 0.34 0.81 0.35 0.28 0.81 0.35 0.29
50% 0.85 0.39 0.36 0.78 0.36 0.30 0.78 0.36 0.30
55% 0.82 0.41 0.38 0.75 0.38 0.31 0.75 0.38 0.31
60% 0.78 0.43 0.39 0.71 0.40 0.33 0.71 0.40 0.33
65% 0.75 0.46 0.41 0.67 0.43 0.34 0.66 0.43 0.34
70% 0.70 0.49 0.42 0.62 0.45 0.35 0.62 0.45 0.34
75% 0.64 0.53 0.42 0.56 0.48 0.35 0.56 0.48 0.35
80% 0.57 0.57 0.42 0.50 0.51 0.35 0.49 0.51 0.34
85% 0.49 0.62 0.42 0.42 0.56 0.34 0.41 0.54 0.33
90% 0.37 0.66 0.38 0.32 0.60 0.32 0.31 0.57 0.30
95% 0.22 0.72 0.31 0.19 0.65 0.26 0.17 0.61 0.23



Tabela C.13: Medidas de acurácia estimadas para o conjunto Bm30.
Limiar MMT STFT (200) STFT (400)
Sn Sp CC Sn Sp CC Sn Sp CC
05% 0.99 0.26 0.12 0.99 0.26 0.10 0.99 0.26 0.12
10% 0.99 0.27 0.17 0.97 0.27 0.14 0.98 0.27 0.16
15% 0.98 0.28 0.20 0.95 0.28 0.17 0.97 0.28 0.20
20% 0.96 0.30 0.23 0.93 0.29 0.20 0.95 0.29 0.22
25% 0.95 0.31 0.26 0.91 0.30 0.22 0.93 0.30 0.24
30% 0.93 0.32 0.28 0.89 0.31 0.24 0.91 0.32 0.26
35% 0.92 0.34 0.31 0.87 0.33 0.26 0.88 0.33 0.27
40% 0.90 0.36 0.33 0.84 0.34 0.27 0.85 0.34 0.29
45% 0.87 0.38 0.35 0.81 0.35 0.29 0.82 0.36 0.30
50% 0.85 0.40 0.37 0.78 0.37 0.30 0.79 0.37 0.31
55% 0.82 0.42 0.38 0.75 0.39 0.32 0.75 0.39 0.32
60% 0.79 0.44 0.39 0.71 0.41 0.33 0.71 0.41 0.33
65% 0.75 0.47 0.41 0.67 0.43 0.34 0.67 0.44 0.34
70% 0.70 0.50 0.42 0.62 0.46 0.35 0.62 0.46 0.35
75% 0.64 0.53 0.42 0.56 0.49 0.35 0.56 0.49 0.35
80% 0.57 0.58 0.42 0.50 0.52 0.35 0.50 0.52 0.35
85% 0.49 0.62 0.42 0.42 0.56 0.34 0.42 0.56 0.34
90% 0.37 0.66 0.38 0.32 0.60 0.32 0.31 0.59 0.30
95% 0.22 0.72 0.30 0.19 0.65 0.26 0.17 0.63 0.24



Tabela C.14: Medidas de acurácia estimadas para o conjunto Bm100.
Limiar MMT STFT (200) STFT (400)
Sn Sp CC Sn Sp CC Sn Sp CC
05% 1.00 0.36 0.16 0.99 0.35 0.15 0.99 0.36 0.16
10% 0.99 0.37 0.22 0.98 0.37 0.20 0.99 0.37 0.23
15% 0.98 0.39 0.27 0.97 0.38 0.23 0.98 0.39 0.27
20% 0.97 0.40 0.30 0.95 0.39 0.26 0.97 0.40 0.30
25% 0.96 0.42 0.34 0.93 0.41 0.29 0.95 0.42 0.33
30% 0.95 0.44 0.37 0.91 0.43 0.31 0.93 0.44 0.36
35% 0.93 0.46 0.40 0.89 0.44 0.33 0.92 0.46 0.38
40% 0.91 0.49 0.42 0.87 0.46 0.35 0.90 0.48 0.40
45% 0.89 0.51 0.44 0.84 0.48 0.37 0.87 0.50 0.42
50% 0.87 0.54 0.47 0.81 0.51 0.39 0.84 0.53 0.44
55% 0.84 0.57 0.48 0.77 0.53 0.40 0.81 0.55 0.45
60% 0.81 0.60 0.50 0.73 0.56 0.42 0.78 0.58 0.47
65% 0.77 0.63 0.51 0.69 0.58 0.43 0.74 0.61 0.48
70% 0.71 0.66 0.51 0.64 0.61 0.43 0.69 0.65 0.48
75% 0.65 0.70 0.50 0.58 0.64 0.42 0.63 0.68 0.48
80% 0.58 0.74 0.49 0.51 0.68 0.42 0.56 0.72 0.47
85% 0.49 0.79 0.47 0.43 0.72 0.40 0.47 0.77 0.45
90% 0.36 0.82 0.41 0.32 0.77 0.36 0.35 0.81 0.40
95% 0.20 0.85 0.31 0.18 0.81 0.28 0.19 0.85 0.30



D. Painéis Apresentados

D.1 International Conference on Bioinformatics and Computational Biology 2004

Bioinformatics Tools for Assembling and Analysis of Chloroplast Genomes
Jesus P. Mena-Chalco$^1$, Henrique S. Alves$^2$, Helaine Carrer$^2$, Roberto M. Cesar-Jr$^1$
$1$ Depto. Ciência da Computação, IME-USP. Rua do Matão, 1010. São Paulo-SP 05508-090.
$2$ Depto. Ciências Biológicas, ESALQ-USP. Av. Pádua Dias, 11. Piracicaba-SP 13418-900.

Chloroplasts are organelles found only in plant and algae cells. They are responsible for photosynthesis and for the synthesis of key molecules required for the basic architeture and functioning of plant cells. These organelles have their own genetic machinery and together with the nucleus and mitochondrial genomes are responsible for celular coordenation activity. At the moment 29 higher plant plastid genomes (plastomes) have been sequenced (http://ncbi.nlm.nih.gov/). The plastome sequences are conserved among species but the genes arrangements are different for divergent plant groups. The knowledge of the nucleotide sequence of chloroplast genomes is important for evolution studies and for biotechnology applications. The chloroplast organelle being used as a model in this study was isolated from Eucalyptus grandis, an important economical tree for the production of paper and cellulose and in Brazil is located the main germoplasm collection of Eucalyptus outside Australia.

We have sequenced 3500 sequences from an Eucalyptus DNA library. These sequences represent so far, 50% of the total plastome sequence of Eucalyptus grandis. These sequences are stored through a special pipeline at the bioinformatics servers at URL http://malariadb.ime.usp.br:8026/pipeline/. Once this phase is accomplished, the next step is the search for similar sequences in other related organisms. Some tentative results towards this direction have been already obtained.

In this study, we apply digital signal processing (DSP) techniques [1, 2, 3] on the genomic data sequences in order to identify and compare DNA and protein sequences of Eucalyptus grandis to the other available higher plant plastomes. We have chosen different approaches to identify protein coding DNA regions and to compare protein sequences. In particular, traditional Fourier analysis and the wavelet transform will be evaluated [4, 5].

References

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D.2 X-Meeting 2005

Protein Coding Regions Identification through the Modified Morlet Transform
Jesús P. Mena-Chalco$^1$, Roberto M. Cesar-Jr$^1$
$1$ Depto. Ciência da Computação, IME-USP. Rua do Matão, 1010. São Paulo-SP 05508-090.

An important topic in biological sequences analysis area is the protein coding regions identification. This identification allows the posterior research for meaning, description or biological categorization of the analyzed organism [1]. Currently, several methods combine pattern recognition with knowledge collected from training datasets of known genes or from comparison with genomic databases. Nonetheless, the accuracy of these methods is still far from satisfactory. New methods of DNA sequences processing and genes identification can be created through search-by-content such sequences [2]. The periodic pattern of DNA in protein coding regions, called three-base periodicity (TBP), has been considered proper of coding regions. This phenomenon was not observed for nonprotein coding. The digital signal processing techniques supply a strong basis for regions identification with TBP [2,3].

In this work we introduce a new method for protein coding regions identification with TBP, based on a wavelet transform, called Modified Morlet Transform (MMT), which does not need to be trained on sequences databases. We use a fixed binary mapping rules to create four binary sequences. Where each one represents the positions of each nitrogenate base in DNA sequence. Next the MMT, with different scales is applied to all binary sequences. The module of each normalized coefficient is projected onto the position axis. Projection onto the scale axis reveal which scale carry more signal energy throughout the positions. The result of the projection position axis represents the protein coding region identificator. These projection coefficients correspond to regions with TBP. Thus, we use thresholding coefficients, based on both shrinking values and inflection points, to exclude positions where the associated energy is lower. At the moment, we consider arbitrary length region criterions for discarding possible very short protein coding regions identification. The performance of the proposed transform was examined by analyzing synthetic and real DNA sequences (RGRC2 and F56F11.4 genes of O. sativa and C. elegans organism, respectively). Preliminary results show that MMT is better than traditional methods by presenting greater sensitivity to TBP and discriminatory capability between protein coding regions.

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Índice Remissivo

ácido
amino : 2.1.2 to 2.1.2
desoxirribonucléico : 2.1.1
nucléico : 2.1.1
ribonucléico : 2.1.1
éxons : 2.3
ADN : see ácido desoxirribonucléico
ARN : see ácido ribonucléico
bases
identificação : 3.1.1
nitrogenadas : 2.1.1 | 4.2
biologia molecular
dogma : 2.1.3 | 2.1.4
fundamentos : 2.1
busca no DNA
por conteúdo : 1.1 | 2.4
por sítios : 2.4
código genético : 2.1.4
códon : 2.1.4
CDS : see região codificante
coeficiente de correlação : 4.6
convolução : 4.1.3
DFT : see transformada discreta de Fourier
DNA : see ácido desoxirribonucléico
DSP : see processamento digital de sinais
escalograma : 5.1
especificidade : 4.6
espectro
freqüência : 4.1.2 | 4.3
espectrograma : 4.1.4
filtros digitais : 4.5
Fourier
análise : 4.1
métodos para a identificação de CDSs : 4.5
transformada : see transformada de Fourier
genes
constituição : 2.1.3
descrição : 3.1.4
expressão : 1.1 | 2.1.4
identificação : 1.1 | 2.4 | 3.1.4 | 4.
genoma
anotação : 3. | 3.1.4
diferença : 3.1.2
fragmentação : 2.2
mapa : 3.1.4
montagem : 2.2 | 3.1.2
projetos : 1.1 | 2.2
seqüenciamento : 1.1 | 2.2 | 3. | 3.1.2
shotgun : 2.2
shotgun hirárquico : 2.2
histograma : 6.3 | A.2
íntrons : 2.3
leituras
edição : 3.1.3
identificação : 3.1.1
limiarização : 5.3.4
mapeamento de nucleotídeos : 4.2
baseado em critérios de otimização : 4.2
fixo : 4.2 | 5.3.1
medidas de acurácia : 4.6 | 6. | C.
MMT : see transformada modificada de Morlet
nucleotídeos : 2.1.1
periodicidade
análise : 4.4
latente : 2.3
região codificante : 1.1 | 2.3 | 4.3 | 4.4 | 6.
região inter-gênica : 2.3
seqüências reais : 4.4.2
seqüências sintéticas : 4.4.1
pipeline bioinformático
definição : 3.
desenvolvido : 1.2 | 3.2
unidades funcionais : 3.1
processamento digital de sinais : 1.1 | 4.2
projeção : 5.3.3
proteínas : 2.1.4
região
codificante : 2.1.4 | 2.3 | 4.3 | 4.3
inter-gênica : 2.1.3 | 2.3
não-codificante : 2.1.3
resolução
tempo-freqüência : 4.1.4
RNA : see ácido ribonucléico
ruído sintético : 4.3
sensibilidade : 4.6
seqüência
binária : 4.2 | 4.2
comprimento : 2. | 4.2
numérica : 4.2
real : 4.4.2
representação : 4.2
sintética : 4.3 | 4.4 | 4.4.1
STFT : see transformada de Fourier de tempo reduzido
TBP : see periodicidade região codificante
transformada
Fourier : 4.1.1 | 4.3
contínua : 4.1.1
discreta : 4.1.1
tempo reduzido : 4.1.4 | 6. | 7.1
modificada de Morlet : 1.2 | 5.2 | 6. | 7.1
aplicação : 5.3.2
Wavelet
análise : 5.1
Morlet : 5.2

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The translation was initiated by Jesus Mena-Chalco on 2006-02-07

Footnotes

... genoma1.1
Material genético de um organismo, contido em um conjunto haplóide de cromossomos.
... tags)1.2
Seqüências pequenas de mRNA (cDNA) que representam o que é expresso pelo gene.
... antiparalela2.1
As fitas de DNA tem polaridade oposta, isto é, correm em sentido oposto (estão orientadas em antiparalelo).
... duplicação2.2
Processo semiconservativo que permite a auto-duplicação de todo o material genético mantendo assim o padrão de herança ao longo das gerações.
... códons2.3
Um códon é considerado como uma trinca de bases que especificam um aminoácido ou indicador de parada de síntese.
... sítios2.4
Coluna individual de resíduos em um alinhamento de aminoácidos ou nucleotídeos. Os resíduos em um sítio são presumidos como homólogos.
... CpG2.5
Presença de sub-regiões ricas em citosina e guanina na região $5'$, que está associada ao efeito da expressão gênica.
...replicons3.1
Uma molécula de DNA capaz de se replicar e se manter.
... CLASS="MATH">$^{\textrm{\scriptsize\texttrademark}}$3.2
Blast, do inglês Basic Local Alignment Search Tool, é um algoritmo de comparação de seqüências usado para a busca de um alinhamento local ótimo.
... tempo4.1
O tempo também poderia ser considerada como a posição de um elemento em um sinal.
...seqüência!binária4.2
Este tipo de seqüências também são conhecidas como seqüências indicadoras binárias, por serem indicadoras de posições.
... energia4.3
Entenda-se a energia como o módulo do coeficiente da transformação.
... três4.4
As demais freqüências não são consideradas no cálculo dos coeficientes, pois pretende-se concentrar-se nas regiões onde exista TBP (Seção 2.3).
... CDSs4.5
Veja sua semelhança com a equação do espectro de freqüência (4.13)
... homólogas4.6
Seqüência similar com relacionamento evolucionário.
... digitais4.7
Os filtros digitais permitem separar ou dividir um sinal nas suas componentes de freqüências [38].
... adaptativa4.8
Refere-se ao fato de mudança iterativa dos valores nas seqüências utilizadas.
...5.1
Também conhecida como wavelet mãe, protótipo ou básica.
... específica5.2
A busca de regiões com periodicidade de três bases, na seqüência de DNA, associadas às regiões codificantes de proteínas.
...5.3
Um comportamento similar de $\psi_{MM}$ pode ser obtido com a utilização de $\omega_0=2N/3$.
... pseudo-genes6.1
Seqüência de DNA derivada originalmente de genes codificantes de proteínas, que foram perdendo sua função.
...Mou017.1
Este tipo de seqüências, geralmente, é usado pelos métodos que utilizam a abordagem de identificação de genes mediante a busca por sítios (Seção 2.4).

Jesus Mena-Chalco: 2005-10-19